鹽度和干露對大竹蟶呼吸代謝相關(guān)酶的影響

李東東，聶鴻濤，劉國龍，閆喜武

( 1.大連海洋大學(xué)，水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023; 2.大連海洋大學(xué)，遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023 )

大竹蟶(Solengrandis)屬軟體動物門、瓣鰓綱、簾蛤目、竹蟶科，廣泛分布于我國沿海地區(qū)，生活在潮間帶至20 m深的淺海，是重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類[1]。大竹蟶營埋棲生活，以海水中微型浮游生物和有機(jī)碎屑為食[2]。大竹蟶個體大、味道鮮美、營養(yǎng)極其豐富。我國海水養(yǎng)殖貝類技術(shù)發(fā)展日益精進(jìn)，生物學(xué)家越來越重視貝類遺傳育種以及貝類保護(hù)的研究[3]。但近年來，海域環(huán)境污染嚴(yán)重和過度捕撈等原因?qū)е麓笾裣|的現(xiàn)存資源量越來越少，因此，大竹蟶的人工規(guī)模養(yǎng)殖對保護(hù)和恢復(fù)大竹蟶資源有重要意義。

鹽度、干露是水產(chǎn)養(yǎng)殖中比較重要的兩個非生物因子，影響著水生生物的生理及存活。聶鴻濤等[4]研究表明，鹽度對大竹蟶耗氧率和排氨率具有較大的影響。高杉等[5]研究表明，鹽度突變至15和35后，大竹蟶稚貝會長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，且大竹蟶稚貝培育的最適鹽度為20～30。陳愛華等[6]研究表明，鹽度對大竹蟶稚貝的生長及存活有較大影響，大竹蟶稚貝最適宜存活的鹽度為20～32，鹽度20時，成活率最大，為85%；最適生長的鹽度為20～28，鹽度24時，大竹蟶稚貝日生長率最大，為1.72%。鹽度突變不僅可以影響免疫因子使機(jī)體的免疫能力下降，還可以通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來影響機(jī)體的免疫能力。張鷺等[7]指出，縊蟶(Sinonovaculacomstricata)在低鹽條件下，血淋巴中磷脂酶A2和鋅指蛋白等6種蛋白會發(fā)生改變，導(dǎo)致縊蟶的死亡率顯著增加。近年來，關(guān)于干露條件對貝類影響的研究在長牡蠣(Crassostreagigas)[8]、墨西哥灣扇貝(Argopectenirradiansconcentricus)幼蟲和稚貝[9]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)幼苗[10]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)幼蟲[11]等中均有報道。長牡蠣成貝的耐干露能力較其稚貝強(qiáng)，并且在低溫條件下干露成活率顯著高于高溫[8]。

呼吸代謝是直接反應(yīng)生物機(jī)體能量代謝的基本生理活動，不僅能反映生物體代謝特征、生理狀態(tài)及營養(yǎng)情況，還能反應(yīng)環(huán)境條件對生物生理活動的影響程度，是水生動物生理學(xué)研究的重要內(nèi)容之一[12-13]。水產(chǎn)動物呼吸代謝類型主要為有氧方式，但在低氧條件下也可通過無氧呼吸代謝方式為機(jī)體提供能量[14]。乳酸脫氫酶是生物機(jī)體無氧條件下糖酵解過程中參與調(diào)節(jié)的重要酶類，其活性可以用來反映無氧呼吸代謝能力[15]。琥珀酸脫氫酶是有氧代謝的首要酶類和衡量指標(biāo)，在三羧酸循環(huán)中起到連接氧化磷酸化與電子傳遞的作用，為細(xì)胞線粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子[13]。在機(jī)體代謝中，堿性磷酸酶發(fā)揮著重要作用，當(dāng)堿性磷酸酶活性降低后，生物體的免疫和代謝能力均會受到影響[16]。

在大竹蟶的養(yǎng)殖中，大竹蟶對環(huán)境的適應(yīng)能力受諸多環(huán)境因子的影響,其中鹽度和干露是兩個重要的環(huán)境因子，對大竹蟶的呼吸、代謝、生長和免疫等有著十分重要的作用[17-19]。消化腺是軟體動物消化和代謝的中心，在貝類消化腺中代謝酶活性處于較高水平[20]。目前，大竹蟶人工育苗、遺傳多樣性等方面的研究已有報道[21-23]，但鮮見鹽度和干露對其影響的相關(guān)研究。筆者以大竹蟶消化腺中呼吸代謝酶活性變化作為指標(biāo)，來反應(yīng)鹽度和干露脅迫對大竹蟶呼吸代謝功能的影響，旨在為大竹蟶的人工規(guī)模化養(yǎng)殖、育成、運(yùn)輸提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大竹蟶取自大連灣海域，殼長(9.16±0.5) cm,殼寬(1.54±0.38) cm,殼高(1.52±0.5) cm，濕質(zhì)量(41.85±0.88) g。在50 cm×30 cm×35 cm的水槽內(nèi)適應(yīng)性暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間，海水鹽度30±1，水溫(14±1) ℃，持續(xù)充氧，日換水1次；定時投喂螺旋藻(Spirulina)粉，日投喂2次，試驗(yàn)前2 d停止投餌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫試驗(yàn)

相同試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)設(shè)置鹽度脅迫和干露脅迫兩組。

鹽度脅迫：暫養(yǎng)結(jié)束后，將大竹蟶隨機(jī)分為5組，以每個水槽30個的密度將大竹蟶置于5個鹽度梯度(15、20、25、30、35鹽度組，30作為對照組)的水槽中，每個水槽中水溫24～26 ℃，pH 8.1～8.3。低鹽度的調(diào)節(jié)是使用經(jīng)過曝氣處理的自來水加入到海水中調(diào)節(jié)，鹽度35高鹽調(diào)節(jié)是將鹽水精加入到海水中調(diào)節(jié)。每個處理3個平行，均在相同條件下脅迫10 d。脅迫時日換水1次、投餌2次，持續(xù)充氣。

干露脅迫：脅迫前挑選經(jīng)馴化7 d后活性良好

的大竹蟶，設(shè)置4個處理組，放入水槽中，水槽底部鋪滿過濾海水浸濕過的沙子，厚10 cm。每個脅迫時間組設(shè)3個平行，每個平行放30個大竹蟶。分別于室溫條件下干露6、12、24、48 h，每個水槽中各取3個大竹蟶的消化腺用于試驗(yàn)分析。對照組在相同條件下養(yǎng)殖。

1.2.2 樣品處理

鹽度脅迫試驗(yàn)和干露脅迫試驗(yàn)每個平行組取3個大竹蟶樣品。將脅迫后的大竹蟶置于冰盤上迅速解剖，每個個體取消化腺0.2～0.4 g，放入預(yù)冷的勻漿器中，加入4倍體積預(yù)冷的0.9%生理鹽水，制備成組織勻漿液，于高速冷凍離心機(jī)中4 ℃、4000 r/min，離心10 min，取上清液用于酶活性檢測。

1.3 蛋白含量和呼吸代謝酶活性的測定

乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶活性用微量酶標(biāo)法測定，總蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測定。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，具體測定方法嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。乳酸脫氫酶活力單位定義為：37 ℃反應(yīng)條件下，每克組織蛋白與基質(zhì)反應(yīng)15 min，反應(yīng)體系中生成1 μL丙酮酸為1個酶活力單位(U)；琥珀酸脫氫酶活力單位定義為：37 ℃ 條件下，每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系的吸光值降低0.01為1個酶活力單位(U)；堿性磷酸酶活力單位定義為：37 ℃條件下，每克組織蛋白與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個酶活力單位(U)。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Microsoft Excel和SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較，以P<0.05作為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度和干露對大竹蟶堿性磷酸酶活力的影響

鹽度逐步升高時，大竹蟶消化腺堿性磷酸酶活力隨時間變化見圖1，大竹蟶堿性磷酸酶活性隨鹽度的升高呈先降后升的變化趨勢。鹽度20時，大竹蟶堿性磷酸酶活性最低，為0.043 U/g，且顯著低于其他各組(P<0.05)；而后逐漸恢復(fù)，鹽度25、30和35時，大竹蟶堿性磷酸酶活力變化不顯著(P>0.05)，鹽度25時，大竹蟶堿性磷酸酶活力處于較高水平，為0.053 U/g，顯著高于鹽度35時的活力(P<0.05)。

圖1 鹽度對大竹蟶消化腺堿性磷酸酶活力的影響相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同.

干露時間對大竹蟶堿性磷酸酶活性的變化見圖2。隨著干露時間的延長，大竹蟶消化腺中堿性磷酸酶活性隨著干露時間的增加而降低，各組堿性磷酸酶活力變化無顯著差異(P>0.05)。干露6 h時堿性磷酸酶活力最高，為0.042 U/g，干露48 h時堿性磷酸酶活力最低，為0.020 U/g。

2.2 鹽度和干露對大竹蟶琥珀酸脫氫酶活力的影響

在鹽度脅迫下，各個鹽度組的大竹蟶消化腺琥珀酸脫氫酶活力變化見圖3。隨著鹽度的變化，消化腺琥珀酸脫氫酶活力出現(xiàn)了先降后升最后恢復(fù)的變化，鹽度20組琥珀酸脫氫酶活力降低，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，鹽度25組的琥珀酸脫氫酶變化明顯，顯著升高(P<0.05)，為0.401 U/mg，高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，鹽度15組和鹽度35組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

不同干露時間脅迫下，大竹蟶琥珀酸脫氫酶活性變化見圖4，隨著干露時間的延長，消化腺中琥珀酸脫氫酶活性變化顯著(P>0.05)，干露脅迫6、12、24 h，琥珀酸脫氫酶活性顯著高于48 h時的活性，且隨著脅迫時間的延長，酶活性呈降低的趨勢(P>0.05)，48 h達(dá)到最低，為0.197 U/mg。其中，干露脅迫6 h時琥珀酸脫氫酶活性為0.538 U/mg，且顯著高于12 h時的活性(P<0.05)；干露脅迫12 h時和24 h時琥珀酸脫氫酶活性分別為0.302 U/mg和0.311 U/mg，顯著高于48 h時的活性(P>0.05)。

圖3 鹽度對大竹蟶消化腺琥珀酸脫氫酶活力的影響

圖4 干露時間對大竹蟶消化腺琥珀酸脫氫酶活力的影響

2.3 鹽度和干露對大竹蟶乳酸脫氫酶活力的影響

隨著鹽度的增加，大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活性變化見圖5。乳酸脫氫酶活力出現(xiàn)先降后升再恢復(fù)的變化。鹽度20時，乳酸脫氫酶活力為0.287 U/g，顯著低于鹽度15時的活力(0.437 U/g)(P>0.05)。鹽度25時，乳酸脫氫酶活力為0.604 U/g，顯著高于鹽度15時的活力(P<0.05)。鹽度30、35時，乳酸脫氫酶活力呈波動變化，但差異不顯著(P>0.05)。

干露脅迫下，大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活力隨時間變化見圖6。干露脅迫6 h時與0、12、24 h時大竹蟶消化腺的乳酸脫氫酶活力差異不顯著(P>0.05)，但干露脅迫48 h時大竹蟶消化腺的乳酸脫氫酶活性(0.187 U/g)明顯降低，顯著低于干露脅迫0、6、12 h和24 h時的活性(P<0.05)。

圖5 鹽度對大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活力的影響

圖6 干露時間對大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活力的影響

3 討 論

3.1 鹽度對大竹蟶呼吸代謝酶活力的影響

乳酸脫氫酶是調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝中無氧代謝酶之一，乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸還原成乳酸，才能使糖酵解順利進(jìn)行[24]，所以能使機(jī)體糖酵解正常運(yùn)行的前提條件是乳酸脫氫酶保持其活性[25]。乳酸脫氫酶與細(xì)胞代謝活動密切相關(guān)，是糖酵解與三羧酸循環(huán)之間的關(guān)鍵酶，其活力大小在一定程度上反映了無氧條件下生物代謝能力的強(qiáng)弱[26]，可作為衡量無氧代謝水平的指標(biāo)之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)鹽度為25時，大竹蟶乳酸脫氫酶活力較高，說明在靠近等滲點(diǎn)的環(huán)境中，機(jī)體內(nèi)無氧代謝水平較高，有助于為大竹蟶的運(yùn)動提供能量保障。隨著內(nèi)外滲透梯度的增大，大竹蟶乳酸脫氫酶活力下降，無氧代謝水平降低，使得進(jìn)入三羧酸循環(huán)的丙酮酸含量增加，三羧酸循環(huán)速度加快，從而為機(jī)體提供更多的能量以適應(yīng)環(huán)境的變化，琥珀酸脫氫酶活力的變化也證明了這一點(diǎn)。

堿性磷酸酶是參與生物體代謝調(diào)控的重要酶類，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，鈣代謝等，對于細(xì)胞調(diào)節(jié)和營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收具有重要作用,是評價生物體生長和免疫的重要指標(biāo)[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽度20時大竹蟶的堿性磷酸酶的活性顯著低于鹽度15、25、30、35時的活性，且當(dāng)高鹽度脅迫時大竹蟶堿性磷酸酶的活力顯著低于對照組的活力(P<0.05)。這說明鹽度為20、35時，對大竹蟶堿性磷酸酶活性的影響較大，且低鹽度的影響顯著高于高鹽度的影響。王瑞芳等[28]的研究表明，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的堿性磷酸酶活性在高鹽度(35)時顯著低于在低鹽度(28)時，且堿性磷酸酶活性隨鹽度的升高而降低。本試驗(yàn)的結(jié)果與其不同，可能與物種的不同有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，堿性磷酸酶活力在鹽度25時最高，但與對照組差異不顯著(P>0.05)，后隨鹽度增加其活性逐步下降，表現(xiàn)出了堿性磷酸酶的滯后性，這與中國血蛤(Hiatulachinensis)在低鹽度下免疫反應(yīng)遲緩的結(jié)果一致[29]，可能是由于低鹽下某些特異性因子受到抑制所致[28]。綜上可知，鹽度25接近大竹蟶堿性磷酸酶活性隨鹽度變化的臨界值。

琥珀酸脫氫酶參與氧化磷酸化作用和三羧酸循環(huán)，是呼吸鏈中的第一個酶，在進(jìn)行有氧呼吸時，琥珀酸脫氫酶在三羧酸循環(huán)中將延胡索酸還原成琥珀酸，為機(jī)體提供能量，從而其活力可在一定程度上反應(yīng)有氧代謝的水平[30]。在本試驗(yàn)中，琥珀酸脫氫酶活性的變化呈“W”型。從整體變化來看，大竹蟶的最適鹽度為25～35，且當(dāng)鹽度為25時，酶活性達(dá)到最高，琥珀酸脫氫酶活力較高，說明此時大竹蟶機(jī)體的有氧代謝水平最高。本試驗(yàn)中不同鹽度下，琥珀酸脫氫酶活力差異的消除也可能與長時間的鹽度馴化有關(guān)。隨著大竹蟶的在脅迫鹽度下的適應(yīng)，其自身的有氧呼吸代謝能力增強(qiáng)，琥珀酸脫氫酶活力增高。

3.2 干露對大竹蟶呼吸代謝酶活力的影響

海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類在養(yǎng)殖和運(yùn)輸中會遭受干露脅迫，干露時間決定脅迫強(qiáng)度。當(dāng)貝類離開水環(huán)境后，需要維持自身的生命力，但是由于缺水后不能進(jìn)行正常的呼吸作用，會導(dǎo)致貝類窒息死亡。貝類對干露脅迫的耐受能力與干露時間的長短、規(guī)格的差異、物種的不同均有一定的關(guān)系，且與時間、溫度成負(fù)相關(guān)；相同物種中，由于成貝的軟體部比稚貝大，體內(nèi)含水量相對較多，成貝比稚貝具有更強(qiáng)的耐干露能力，成活率高[8]。

大竹蟶生活在潮間帶到20 m水深的淺海，埋棲在深度30～40 cm的泥灘或沙灘中。在自然界中，除了受到溫度、鹽度和其他環(huán)境條件的影響外，由于四季變換、環(huán)境突變等，大竹蟶也會受到不同程度干露的脅迫，自身的呼吸代謝酶活力會受到影響[1]。通過測定不同干露時間下堿性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的活性，掌握干露時間對大竹蟶呼吸代謝酶活力的變化規(guī)律，從而探明干露對大竹蟶耐受能力的影響。在缺氧或者動物機(jī)體本身代謝過于旺盛但氧氣供應(yīng)不足的環(huán)境條件下，機(jī)體能量的供應(yīng)主要通過糖酵解作用，堿性磷酸酶對糖酵解也有著重要作用[24]。堿性磷酸酶是溶酶體中重要的溶解酶，直接參與體內(nèi)磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收相關(guān)[31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著干露時間的延長，3種酶的活力呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢。隨著干露時間的延長，琥珀酸脫氫酶的活力逐漸降低，當(dāng)干露時間超過24 h后，下降愈發(fā)明顯，表明隨著干露時間延長，大竹蟶的有氧代謝水平逐漸降低。隨著干露時間延長，乳酸脫氫酶活力呈現(xiàn)總體下降趨勢，但當(dāng)干露時間延長至24 h，其活性較12 h時略有上升。隨著干露時間延長，大竹蟶的琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活力均呈先降低后平穩(wěn)再下降的變化趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。表明干露脅迫24 h后，大竹蟶機(jī)體仍具有自我修復(fù)能力，但長時間的干露必然會損傷大竹蟶的代謝能力，與段亞飛等[32]的研究結(jié)果一致。隨著干露時間的延長，堿性磷酸酶活力呈持續(xù)下降趨勢，各梯度下的酶活力差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，大竹蟶耐干露的時間范圍在24 h以內(nèi)，超出這一范圍，其存活率和酶活力均出現(xiàn)不可逆的急劇下降。