鱘源致病性魯氏耶爾森菌的分離、鑒定及藥敏研究

楊昆明，張文潤(rùn)，馬江霞，段成任，郭愛(ài)民，謝志勝，岳 城

( 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 )

全世界現(xiàn)存26種鱘[1]，我國(guó)試養(yǎng)的鱘多達(dá)十幾種，目前形成規(guī)模養(yǎng)殖的種類主要有施氏鱘(Acipenserschrenckii)、西伯利亞鱘(A.baerii)、雜交鱘(Husodauricus♀ ×A.schrenckii♂)和匙吻鱘(Polyodonspathula)，約占鱘養(yǎng)殖總產(chǎn)量的90%以上[2-3]。西伯利亞鱘在20世紀(jì)90年代末引入我國(guó)，并成功進(jìn)行了人工繁育。因其具有生長(zhǎng)速度快、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、肉厚骨軟、營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美和魚(yú)籽品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)，成為我國(guó)目前鱘魚(yú)養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一[4]，也是新疆地區(qū)現(xiàn)階段主要養(yǎng)殖的鱘魚(yú)品種之一。隨著集約化養(yǎng)殖的大力開(kāi)展，養(yǎng)殖水體污染、餌料污染、漁撈的混用污染等問(wèn)題接踵而至，高密度的養(yǎng)殖及落后的病害防治技術(shù)導(dǎo)致養(yǎng)殖鱘魚(yú)暴發(fā)性疾病日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2017年10月，新疆阜康某人工養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖的西伯利亞鱘出現(xiàn)攝食量下降，精神萎靡，泄殖孔紅腫外突等病征，少數(shù)魚(yú)在下頜、腹部等皮膚處有明顯出血點(diǎn)或斑點(diǎn)。發(fā)病水溫20 ℃，日死亡率達(dá)15%～20%，給養(yǎng)殖者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為查明造成西伯利亞鱘死亡的原因，筆者采用臨床剖檢、寄生蟲(chóng)學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)等方法進(jìn)行診斷，在排除寄生蟲(chóng)感染和病毒感染造成死亡的情況下，懷疑是細(xì)菌感染所致。無(wú)菌剖檢病鱘內(nèi)臟，進(jìn)行細(xì)菌分離純化，通過(guò)革蘭氏染色、生理生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)試驗(yàn)、藥物敏感性試驗(yàn)對(duì)分離菌進(jìn)行了初步鑒定，在此基礎(chǔ)上通過(guò)測(cè)序?qū)?xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，以探討分離菌在所屬菌群中的分類位置。本研究旨在豐富西伯利亞鱘細(xì)菌病病原研究資料，為鱘魚(yú)魯氏耶爾森菌病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)，并為新疆地區(qū)西伯利亞鱘健康養(yǎng)殖和疾病防控增加新的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

采自新疆阜康某養(yǎng)殖場(chǎng)患病西伯利亞鱘8尾，患病魚(yú)泄殖孔紅腫外突，少數(shù)魚(yú)在下頜、腹部等皮膚處有明顯出血斑或出血點(diǎn)。體質(zhì)量約180～220 g，用于病理剖檢、病料采集和病原菌分離。剖檢時(shí)僅有2尾魚(yú)存活，但已側(cè)翻，其余6尾全部死亡。試驗(yàn)用西伯利亞鱘來(lái)自該場(chǎng)未發(fā)病同批次魚(yú)池，體質(zhì)量約150～200 g，在試驗(yàn)室暫養(yǎng)3周，確定健康無(wú)病后用于回歸感染試驗(yàn)。

LB瓊脂、M-H培養(yǎng)基、M-H瓊脂培養(yǎng)基(青島日水生物技術(shù)有限公司)；細(xì)菌微量生化試驗(yàn)管、革蘭氏染液、藥敏紙片(杭州天河微生物試劑有限公司)；2xEasyTaq SuperMix、膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒(全式金生物科技有限公司)；細(xì)菌16S rRNA通用引物序列測(cè)定由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2 剖檢觀察

肉眼檢查病魚(yú)體表有無(wú)甲殼類體表寄生蟲(chóng)，同時(shí)分別刮取鰓絲、體表黏液在載玻片上，并在體視顯微鏡下觀察黏液中是否有寄生體表原蟲(chóng)。依次檢查病魚(yú)頭部、體表、腹部、鰭條、肛門等處有無(wú)病變；剖開(kāi)腹部檢查有無(wú)腹腔液，肝臟、膽囊、脾臟、腎臟等器官質(zhì)地、形態(tài)及有無(wú)出血，腸壁彈性及腸道有無(wú)內(nèi)容物。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

用75%酒精噴灑患病鱘魚(yú)體表，并用酒精棉球反復(fù)擦拭，用滅菌手術(shù)剪剖開(kāi)魚(yú)腹部，采集病魚(yú)肝臟、脾臟、腸、腎。用接菌環(huán)蘸取腹腔液在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線；內(nèi)臟用無(wú)菌PBS液反復(fù)沖洗5遍，滅菌手術(shù)剪剪開(kāi)后用橫斷面在LB瓊脂培養(yǎng)基上單向涂抹，再持接菌環(huán)在涂抹處劃線，20 ℃倒置培養(yǎng)16～24 h。挑取形態(tài)一致的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行分離傳代純化培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌鑒定

接菌環(huán)滅菌挑取瓊脂平板上單個(gè)菌落，經(jīng)稀釋、涂片、固定、染色后，顯微鏡油鏡下觀察菌體形態(tài)和顏色，鏡下觀察菌體單一菌落后，在瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種于M-H液體培養(yǎng)基，置于20 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用培養(yǎng)的菌液進(jìn)行葡萄糖、硫化氫等生理生化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行分析。

將經(jīng)M-H培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液與30%甘油(6∶4)注入到EP管中混勻并用封口膜封口，至-80 ℃冰箱中保存。以菌液為底物，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。選用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rRNA，正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGC-3′，反向引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：2xEasyTaq SuperMix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，底物2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，連接轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，用Mega 6.0軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 致病菌藥敏試驗(yàn)

吸取100 μL M-H液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基表面，用燒灼后的無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片以適當(dāng)間隔粘貼于瓊脂培養(yǎng)基表面，并輕壓藥敏紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸。正置0.5 h，然后倒置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的大小來(lái)判斷該菌對(duì)相應(yīng)藥物的敏感程度[12]。

1.6 回歸感染試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)菌液密度組，每個(gè)密度組設(shè)2個(gè)梯密度，高密度組為1×109、1×108cfu/mL，中密度組為1×107、1×106cfu/mL，低密度組為1×105、1×104cfu/mL。測(cè)定目標(biāo)菌液在600 nm下的吸光值(OD600)，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成相應(yīng)密度的細(xì)菌懸濁液。胸鰭基部注射每尾0.1 mL，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水，每組注射8尾，保持水溫20 ℃，不間斷供氧，連續(xù)觀察7 d，每日定時(shí)投喂，觀察并記錄試驗(yàn)魚(yú)的癥狀及每日死亡數(shù)目，發(fā)現(xiàn)死魚(yú)及時(shí)撈出并剖檢，檢查其體表及內(nèi)臟器官的病變情況并做記錄，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌分離。根據(jù)寇氏法計(jì)算半數(shù)致死密度(LD50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體表檢查及病理剖檢結(jié)果

患病鱘魚(yú)泄殖孔紅腫外突，少數(shù)魚(yú)在下頜、腹部等皮膚處有明顯出血點(diǎn)或斑點(diǎn)。剖開(kāi)腹部有少量清亮腹水；體壁及肌肉未出血；肝臟輕微腫大，在肝小葉尖端可見(jiàn)大的出血斑(圖1)；脾臟色深輕微腫大，腎臟正常；腸道內(nèi)有食物，腸系膜及脂肪有小的出血點(diǎn)；性腺有出血點(diǎn)。

2.2 致病菌形態(tài)特征

自患病魚(yú)肝臟、性腺、脾臟分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌XB2，該菌為革蘭氏陰性菌，短桿菌或球桿菌，菌體兩端鈍圓，成對(duì)或單獨(dú)存在(圖2)。在LB瓊脂培養(yǎng)基上，菌株XB2可形成邊緣整齊，透明或灰白色，微隆起，表面光滑，直徑1.0～1.5 mm(20 ℃，24 h)的菌落，在血瓊脂平板上未形成溶血圈。

2.3 生理生化結(jié)果

生理生化反應(yīng)顯示菌株XB2產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，V-P反應(yīng)呈陽(yáng)性，能利用蔗糖、果糖、葡萄糖、明膠、枸櫞酸；在含1%(m/V)氯化鈉中能生長(zhǎng)，高于3%(m/V)氯化鈉中不生長(zhǎng)；在4 ℃以下、37 ℃以上不生長(zhǎng)，20～30 ℃均能正常生長(zhǎng)；不利用乳糖、水楊苷、纖維二糖、硫化氫、酒石酸、阿拉伯糖。菌株XB2生理生化特性接近魯氏耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株(表1)。

2.4 PCR鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

對(duì)菌株XB2的16S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)長(zhǎng)度約為1500 bp的片段。測(cè)序反饋序列上傳美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心進(jìn)行基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株XB2與魯氏耶爾森菌相似性最高。將16S rRNA序列在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)上同時(shí)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果相同，菌株XB2與魯氏耶爾森菌的相似率達(dá)99.43%。將序列上傳美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，獲得序列號(hào)為MG581405。選擇15個(gè)耶爾森菌屬標(biāo)準(zhǔn)參考株，運(yùn)用Mega 6.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)為外類群，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，菌株XB2與湖北株魯氏耶爾森菌KJ812974聚為一支(圖3)。結(jié)合生理生化鑒定及基因序列對(duì)比分析，確定菌株XB2為魯氏耶爾森菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用25種水產(chǎn)常用藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)判定結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)VET01-A4標(biāo)準(zhǔn)[13]。藥敏結(jié)果顯示，魯氏耶爾森菌XB2對(duì)氟苯尼考、左氧氟沙星、哌拉西林、阿洛西林等9種藥物敏感；對(duì)麥迪霉素、大觀霉素、鏈霉素、氨芐西林等15種藥物呈現(xiàn)不敏感或者耐藥(表2)。

圖1 病理剖檢

圖2 分離菌株XB2革蘭氏染色(油鏡×1000)

測(cè)試項(xiàng)目菌株XB2魯氏耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株[11]測(cè)試項(xiàng)目菌株XB2魯氏耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株[11]V-P反應(yīng)++蔗糖+-硫化氫--果糖++明膠++1%NaCl++葡萄糖++3%NaCl-+纖維二糖--4%NaCl--西蒙氏枸櫞酸鈉++5%NaCl--酒石酸--4 ℃--乳糖--20 ℃++水楊苷--30 ℃++阿拉伯糖--37 ℃--

注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng).

圖3 分離菌株XB2 16S rRNA基因與同源性菌株相應(yīng)基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

抗生素含藥量μg/片抑菌圈直徑/mmRIS實(shí)測(cè)抑菌圈直徑mm判定結(jié)果慶大霉素10≤1213～14≥1711R左氧氟沙星30≤1314～16≥1722S阿米卡星30≤1415～16≥1713I鏈霉素10≤1112～14≥150R頭孢噻肟30≤1412～22≥2327S頭孢唑肟30≤1415～19≥2028S大觀霉素5≤1415～17≥182R氨曲南30≤1516～21≥2230S多黏菌素B300≤88～11≥1215S哌拉西林100≤1718～20≥2122S麥迪霉素30≤1314～17≥180R氨芐西林10≤1514～16≥170R克拉霉素2≤1314～17≥182R阿奇霉素15≤1314～17≥1814I青霉素G10≤19-≥200R恩諾沙星10≤1213～16≥1713I卡那霉素30≤1314～17≥1814I苯唑西林1≤1011～12≥130R四環(huán)素30≤1415～19≥2018I氟苯尼考30≤1213～17≥1828S米諾環(huán)素30≤1415～19≥2018I妥布霉素10≤1213～14≥1511R阿洛西林75≤17-≥2020S頭孢他啶30≤1415～17≥1822S

注：R表示低度敏感或不敏感；I表示中度敏感；S表示高度敏感.

2.6 回感試驗(yàn)結(jié)果

健康西伯利亞鱘腹部注射魯氏耶爾森菌XB2后12 h，高密度組和中密度組表現(xiàn)為不攝食、游動(dòng)緩慢、對(duì)外界的刺激不敏感等現(xiàn)象，24 h后高密度組出現(xiàn)死亡，36 h后中密度組出現(xiàn)死亡。對(duì)照組全部正常。將死魚(yú)及時(shí)撈出進(jìn)行體表檢查，可見(jiàn)生殖孔紅腫外突，剖檢可見(jiàn)，肝臟呈灰白色，上面布滿紅暈，脾臟輕微腫大且顏色深，腸系膜、脂肪以及性腺有小出血點(diǎn)，肌肉未見(jiàn)出血。整體病變與自然發(fā)病鱘魚(yú)相似，自感染死亡西伯利亞鱘的肝臟、脾臟等組織分離到與魯氏耶爾森菌XB2的形態(tài)、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析一致的細(xì)菌，表明魯氏耶爾森菌XB2是造成此次西伯利亞鱘患病的病原菌。

表3 人工回感試驗(yàn)

3 討 論

3.1 西伯利亞鱘細(xì)菌病研究進(jìn)展

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于鱘魚(yú)細(xì)菌性疾病的報(bào)道日漸增多，致病菌種類也隨之增加。自患病鱘魚(yú)肝臟和心臟分離出兩株停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[14]，自脾臟、腎臟分離出海豚鏈球菌(S.iniae)[15]，自鱘魚(yú)肝臟[16-17]、性腺[18]分離出嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，自鱘魚(yú)體內(nèi)分離出魯氏耶爾森菌[19]。由此可知，細(xì)菌性疾病已使鱘魚(yú)的健康養(yǎng)殖受到巨大的威脅，成為其養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的瓶頸之一。

3.2 分離菌鑒定結(jié)果及目前細(xì)菌鑒定方法的利弊

自發(fā)病的西伯利亞鱘的肝臟、脾臟分離得到一株革蘭氏染色陰性短桿菌XB2，由人工感染剖檢可見(jiàn)，發(fā)病魚(yú)肝臟有點(diǎn)狀出血斑，脾臟表面粗糙，腫大，與自然發(fā)病癥狀一致，從肝臟、脾臟分離出與菌株XB2形態(tài)、理化性質(zhì)相一致的菌株，表明該菌株對(duì)鱘魚(yú)有明顯的致病性。經(jīng)對(duì)菌株XB2的16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST對(duì)比后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，菌株XB2與魯氏耶爾森菌湖北株KJ812974聚為一支。

目前細(xì)菌的鑒定方法主要包括表型鑒定和分子遺傳學(xué)鑒定兩大類。表型鑒定包括細(xì)菌形態(tài)和生理生化及其蛋白鑒定；分子遺傳學(xué)鑒定是在核酸水平上的鑒定[20]。細(xì)菌形態(tài)鑒定法是經(jīng)典且常用的分類學(xué)方法，操作流程已經(jīng)程序化，但是鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，而且容易受操作者的操作手法，生化反應(yīng)本身的不完整性，結(jié)果判斷誤差等造成鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。在本研究中，生理生化反應(yīng)顯示，菌株XB2產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，V-P反應(yīng)呈陽(yáng)性，能利用蔗糖、果糖、葡萄糖、明膠、枸櫞酸；而魯氏耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株不能利用蔗糖和葡萄糖[11]。分子遺傳學(xué)鑒定法通過(guò)PCR技術(shù)將細(xì)菌的16S rRNA、ropB、gyrB等基因大量擴(kuò)增出來(lái)，并進(jìn)行BLAST比對(duì)，可靈敏、快速且準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)菌的種屬進(jìn)行鑒定，但是不足之處在于對(duì)目標(biāo)菌樣的純度要求高。綜上所述，如若將表型鑒定和分子遺傳學(xué)鑒定同時(shí)用在鑒定細(xì)菌上，結(jié)果愈加真實(shí)可靠。本研究通過(guò)對(duì)菌株XB2的16S rRNA基因序列擴(kuò)增，并進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株XB2與魯氏耶爾森菌KJ812974同源性達(dá)99.43%，結(jié)合革蘭氏染色、生理生化試驗(yàn)結(jié)果，確定菌株XB2為魯氏耶爾森菌。

3.3 魯氏耶爾森菌XB2藥敏結(jié)果分析

3.4 魯氏耶爾森菌中草藥的防治

除了通過(guò)化學(xué)藥品和疫苗防控鱘源魯氏耶爾森菌外，陶健等[24]對(duì)魯氏耶爾森菌進(jìn)行了中草藥試驗(yàn)，采用試管二倍稀釋法測(cè)定了16種中草藥單方及5種復(fù)方制劑對(duì)魯氏耶爾森菌的最小抑菌質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，黃芩和訶子對(duì)魯氏耶爾森菌的抑菌作用最強(qiáng)，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.028 g/mL；5種復(fù)方制劑中，大黃、黃柏和黃芩3種中草藥以5∶3∶2的比例配伍對(duì)魯氏耶爾森菌具有最佳抑菌效果，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.057 g/mL，抑菌效果弱于黃芩，但遠(yuǎn)強(qiáng)于大黃單獨(dú)使用，為該細(xì)菌性疾病的防治提供復(fù)方配伍參考。41種中草藥對(duì)鱘源魯氏耶爾森菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，烏梅、石榴皮、地榆、杞子對(duì)魯氏耶爾森菌有明顯抑菌作用[25]。綜上所述，使用中草藥防控鱘源魯氏耶爾森菌不但操作方便，而且綠色健康，不會(huì)造成病原菌產(chǎn)生耐藥性。