不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠的藥效學對比研究＊

李嘉萌，楊容芳，余豐君，馮淬靈，王 晶＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京100029；2.北京大學人民醫(yī)院 北京100044）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以持續(xù)氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，其主要特征為進行性的氣流受限。全球疾病負擔研究（the Global Burden of Disease Study）報告指出，2016年全球有2.51億例COPD病例。2015年，全球估計有317萬人死于COPD，相當于同年全世界所有死亡人口的5%[1]。COPD患者最常見的癥狀是呼吸急促、慢性咳嗽和痰（粘液）多?；颊呖砂l(fā)生小氣道重塑，氣道黏膜上皮細胞增生，纖毛上皮異常，管壁杯狀細胞增多，細胞外基質沉積，平滑肌增厚纖維化等[2]。其危險因素有吸煙、空氣污染、呼吸系統(tǒng)感染等[3]。研究表明，吸煙是COPD的主要致病原因，且遠遠超過其他危險因素。因此，COPD的發(fā)病機制與香煙煙霧暴露對肺的影響密切相關[4]。COPD在發(fā)病過程中病理生理學改變是個體與其環(huán)境相互作用的結果。這些作用機制主要包括炎癥反應、氧化應激[5]、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、修復異常等。慢性炎癥反應進而會導致呼吸道黏液分泌過多，氣道重塑以及肺泡破壞，因此近年來被認為是COPD主要的發(fā)病機制。

芪蛭益肺顆粒由益氣活血化痰基本方得來，為東直門醫(yī)院院內制劑，全方以黃芪、水蛭為君藥，主要針對COPD穩(wěn)定期氣虛血瘀痰阻根本病機。此藥臨床應用二十余年，療效確切，治療穩(wěn)定期COPD在本領域屬于先行者，樣本量及基礎研究工作均有優(yōu)勢[6,7]。

《醫(yī)學源流論》中記載道：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此[8]。”中藥復方全方水提工藝與傳統(tǒng)中藥的使用方式最為接近，但缺點在于在提取有效成分的同時，許多多糖、鞣質、水溶性雜質等與治療作用不相關的成分也被提出，導致患者在用藥過程中服用量較大。中藥復方全方水提醇沉工藝是在全方水提工藝的基礎上加入乙醇，在提取的同時起到了進一步精制的作用，為減少藥物用量提供了基礎。因此，中藥復方全方水提醇沉工藝相比于全方水提工藝或更有優(yōu)勢[9]。然而，采用全方水提醇沉工藝制備的中藥顆粒劑與全方水提工藝得到的顆粒劑在藥效上是否一致目前還未完全明確，且因復方顆粒中所含藥物的成分不同而不同。為了篩選出藥效學作用更佳的制備工藝，本實驗對芪蛭益肺顆粒的全方水提和全方水提醇沉工藝進行了藥效學的比較研究，為其臨床治療和新藥開發(fā)提供依據(jù)，使其發(fā)揮更大的生物學效應。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立與分組

SPF級Wistar大鼠126只，雌56只，雄70只，鼠齡8周，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2014-0006。適應性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。其中23只為空白組，其余103只大鼠用于造模。使用香煙煙霧暴露復合氣道滴入LPS的方法建立COPD大鼠模型。采用自制煙熏箱煙熏大鼠，每次點燃大前門牌香煙8支，每次煙熏10只大鼠，香煙煙霧暴露28 d，每日上午1次，每次30 min；用生理鹽水將LPS粉末配制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，LPS以200μL/只的劑量分別于第1、11、21 d由氣道內滴入，滴藥日不熏煙。造模第21 d分別從空白對照大鼠及造模大鼠中各取7只雄性大鼠，測定肺功能各指標：MVV、FVC、FEV25-75%、FEV0.3/FVC%，進行給藥前模型復制成功鑒定。將剩余模型大鼠隨機分為模型組、羅紅霉素組（0.03 g·kg-1）、工藝1大劑量組（臨床等效劑量，9.10 g·kg-1）、工藝1小劑量組（1/2臨床等效劑量，4.55 g·kg-1）、工藝2大劑量組（臨床等效劑量，9.10 g·kg-1）、工藝2小劑量組（1/2臨床等效劑量，4.55 g·kg-1），每組16只，雌雄各半。實驗第21 d起，模型組及空白組每日以1 mL/100 g常水灌胃一次，給藥組大鼠每日以1 mL/100 g灌胃給予相應藥物一次，連續(xù)給藥40 d。

1.2 主要試劑與藥品

工藝1全方水提芪蛭益肺顆粒（北京中醫(yī)藥大學中藥制劑系，出膏率36%）；工藝2全方水提醇沉芪蛭益肺顆粒（北京中醫(yī)藥大學中藥制劑系，出膏率16%）；羅紅霉素膠囊（江蘇揚子江藥業(yè)集團公司，批準文號H10970292）；LPS（美國Sigma公司，L2880），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，生產批號：201603），大前門香煙（上海煙草公司，烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量14 mg）。

表1 煙熏復合氣道滴注LPS造模法對COPD模型大鼠肺功能的影響（雄；±S；n=7）

表1 煙熏復合氣道滴注LPS造模法對COPD模型大鼠肺功能的影響（雄；±S；n=7）

注：與空白組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。

組別空白模型劑量/（g·kg-1）__MVV/mL 121.010±9.330 107.100±8.930#FVC/mL 19.595±5.490 13.805±2.986#FEV25-75%/（mL·s-1）13.988±2.784 10.361±2.456#FEV0.3/FVC%59.743±9.303 34.110±6.411##

1.3 實驗儀器

AniRes2005動物肺功能分析儀（北京貝蘭博科技有限公司），漩渦混合器QL-901型（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），GL-21M高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），JA1103N精密天平（上海民橋精密科學儀器有限公司），YP2001N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

1.4 標本采集

實驗第21 d上午給與氣道滴注LPS后，于當日下午取模型組和空白組各7只雄性大鼠進行肺功能測定以預判COPD模型大鼠是否造模成功。實驗于第61 d取材，用1.5%的戊巴比妥鈉以80 mg·kg-1的劑量使大鼠處于深麻狀態(tài)，依次進行肺功能測定、肺組織取材、肺組織固定等操作。

1.5 檢測方法

1.5.1 肺功能測定

待動物處于深麻狀態(tài)，于頸部鈍性剝離出氣管，在氣管中端剪一V字型小口，插入氣管插管，用手術縫合線在氣管外結扎，使動物的呼吸通路與體描箱隔離，防止呼吸氣體進入體描箱。把動物放在體描箱的支撐板上，將氣管插管與體描箱的氣路相連，觀察到氣道壓力曲線顯示空白后，進行肺功能相關指標測定。

1.5.2 肺指數(shù)測定

取出大鼠肺臟，完整分離出氣管和雙肺，仔細除去周圍結締組織，經(jīng)生理鹽水洗滌后濾紙吸干，電子天平稱量整肺濕重，計算肺指數(shù)?！痉沃笖?shù)=肺濕重（g）/大鼠體重（g）】

1.5.3 COPD模型大鼠肺組織病理形態(tài)學觀察

（1）HE染色：

大鼠肺組織經(jīng)脫水與透明、浸蠟與包埋、切片和烤片、脫蠟染色、中性樹膠封片等操作處理后，用光學顯微鏡對肺組織氣道炎癥進行觀察，并用Image-Pro Plus6.0圖片處理軟件進行拍片。

（2）AB-PAS染色：

按照AB-PAS染色試劑盒進行操作。大鼠肺組織經(jīng)脫蠟、阿利新藍染色液染色、蒸餾水洗、過碘酸溶液氧化、Schiff Reagent浸染、蘇木素染色液染核、酸性分化液分化、Scott藍化液返藍、常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固等操作處理后，采用光學顯微鏡對大鼠肺組織氣道纖毛上的杯狀細胞進行觀察，并拍照，從左至右連續(xù)選取三條完整的纖毛，用Image-Pro Plus6.0對杯狀細胞數(shù)目進行統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 煙熏復合氣道滴注LPS造模法對COPD模型大鼠肺功能的影響

實驗結果見表1。與空白組相比較，模型組MVV、FVC、FEF25-75%、FEV0.3/FVC%均具有顯著性差異（P<0.05），證明COPD模型大鼠造模成功。

2.2 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺功能的影響

實驗結果見表2-1及表2-2。與空白組相比較， 型組FEV0.3、FEV0.3/FVC%、FEF25-75%、PEF、MVV、Cdyn均顯著降低（P<0.01或P<0.05），RL顯著升高（P<0.05），表明模型組肺功能出現(xiàn)嚴重損傷；與模型組相比較，羅紅霉素組FVC、FEV0.3/FVC%、PEF、MVV、Cdyn均顯著升高（P<0.01或P<0.05），RL、Re顯著降低（P<0.01或P<0.05）；與模型組相比較，工藝1大劑量組FEV0.3/FVC%、MVV顯著升高（P<0.01），RL顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，工藝1小劑量組FEV0.3/FVC%、MVV顯著升高（P<0.01），RL顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，工藝2大劑量組FEV0.3/FVC%、MVV均顯著升高（P<0.01），RL顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，工藝2小劑量組FEV0.3/FVC%、MVV、Cdyn均顯著升高（P<0.01），RL、Re顯著降低（P<0.01或P<0.05），表明給與芪蛭益肺顆粒治療之后，COPD模型大鼠肺功能出現(xiàn)好轉。

表2-1 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺功能的影響（±S；n=16）

表2-1 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺功能的影響（±S；n=16）

注：與空白組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。與模型組相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

組別空白模型羅紅霉素工藝1大劑量工藝1小劑量工藝2大劑量工藝2小劑量劑量/（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550 FVC/mL 13.814±1.033 12.976±1.411 14.190±0.814*13.698±0.984 13.412±1.010 13.329±1.094 13.870±1.419 FEV0.3/mL 8.753±0.954 7.630±0.317##7.959±0.638 7.858±0.492 7.640±0.564 7.647±0.573 7.687±0.451 FEV0.3/FVC%/%66.326±6.684 56.508±1.342##59.347±2.933**59.333±3.107**59.544±1.835**60.488±2.705**60.496±2.766**FEV25-75%/（mL·s-1）28.655±3.594 24.752±0.880##25.631±2.726 24.803±2.017 24.654±1.882 24.612±1.823 24.978±1.537 PEF/（mL·s-1）36.408±2.318 33.403±1.709##34.820±2.014*33.479±2.473 33.541±2.178 33.491±1.759 33.830±1.196

表2-2 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺功能的影響（±S；n=16）

表2-2 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺功能的影響（±S；n=16）

注：與空白組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。與模型組相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

組別空白模型羅紅霉素工藝1大劑量工藝1小劑量工藝2大劑量工藝2小劑量劑量/（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550 MVV/mL 240.400±7.601 227.438±8.458##238.800±8.995**239.400±8.569**239.067±10.557**243.309±7.009**241.011±9.608**RL/（cmH2O·s-1·mL-1）0.239±0.036 0.275±0.040#0.211±0.029**0.212±0.022**0.214±0.032**0.212±0.026**0.211±0.042**Re/（cmH2O·s-1·mL-1）0.342±0.044 0.349±0.027 0.331±0.027*0.343±0.038 0.341±0.029 0.340±0.035 0.333±0.031*Cdyn/（mL·cmH2O-1）0.325±0.027 0.305±0.034#0.336±0.023**0.321±0.026 0.321±0.032 0.324±0.025 0.336±0.017**

表3 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺指數(shù)的影響（±S；n=16）

表3 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺指數(shù)的影響（±S；n=16）

注：與空白組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。與模型組相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

組別空白模型羅紅霉素工藝1大劑量工藝1小劑量工藝2大劑量工藝2小劑量劑量（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550肺指數(shù)0.004±0.001 0.005±0.001#0.004±0.000*0.005±0.001 0.005±0.001 0.005±0.000 0.004±0.001*

表4 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺組織中杯狀細胞數(shù)目的影響（±S；n=16）

表4 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺組織中杯狀細胞數(shù)目的影響（±S；n=16）

注：與空白組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。與模型組相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

組別空白模型羅紅霉素工藝1大劑量工藝1小劑量工藝2大劑量工藝2小劑量劑量/（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550杯狀細胞數(shù)目/個53.100±7.249 62.500±9.265#53.200±8.817*52.100±12.233*54.700±5.208*45.300±12.676**52.800±10.369*

2.3 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺指數(shù)的影響

實驗結果見表3。與空白組相比較，模型組肺指數(shù)顯著升高（P<0.05），表明模型組肺組織出現(xiàn)損傷；與模型組相比較，羅紅霉素組、工藝2小劑量組肺指數(shù)顯著降低（P<0.05）；與模型組相比較，工藝1大劑量組、工藝1小劑量、工藝2大劑量組肺指數(shù)不具有統(tǒng)計學差異（P>0.05）；表明給與芪蛭益肺顆粒干預之后，工藝2小劑量組COPD模型大鼠肺組織出現(xiàn)好轉。

2.4 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺組織病理形態(tài)學的影響

實驗結果見圖1。HE染色可見，與空白組相比，模型組大鼠氣管可見大量炎癥細胞浸潤，氣管纖毛脫落，呈現(xiàn)COPD病理狀態(tài)。與模型組相比較，羅紅霉素組、工藝1和工藝2大、小劑量組大鼠氣管周圍炎性細胞減少，肺間隔變小，COPD病理過程得到有效緩解。

實驗結果見表4、圖2。AB-PAS染色可見，與空白組相比較，模型組杯狀細胞數(shù)目顯著升高（P<0.05）；與模型組相比較，羅紅霉素組、工藝1大、小劑量組、工藝2大、小劑量組杯狀細胞數(shù)目顯著減少（P<0.01或P<0.05），說明給予芪蛭益肺顆粒能夠有效抑制COPD模型組氣道杯狀細胞化生。

2.5 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠的藥效對比

實驗結果見表5。與工藝1大劑量相比，工藝2大劑量在杯狀細胞數(shù)目上表現(xiàn)的更加優(yōu)效；與工藝1小劑量相比，工藝2小劑量在Re、Cdyn以及肺指數(shù)這三個指標上表現(xiàn)更為優(yōu)效。

圖1 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠肺組織的影響（氣道；×100；HE染色）

圖2 不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠杯狀細胞數(shù)目的影響（×400；AB-PAS染色）

表5 不同工藝的芪蛭益肺顆粒藥效對比表（±S；n=16）

表5 不同工藝的芪蛭益肺顆粒藥效對比表（±S；n=16）

注：與空白組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。與模型組相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

組別空白模型工藝1大劑量工藝1小劑量工藝2大劑量工藝2小劑量劑量/（g·kg-1）__9.10 4.55 9.10 4.55肺指數(shù)0.004±0.001 0.005±0.001#0.005±0.001 0.005±0.001 0.005±0.000 Cdyn/（mL·cmH2O-1）0.325±0.027 0.305±0.034#0.321±0.026 0.321±0.032 0.324±0.025 Re/（cmH2O·s-1·mL-1）0.342±0.044 0.349±0.027 0.343±0.038 0.341±0.029 0.340±0.035杯狀細胞數(shù)目/個53.100±7.249 62.500±9.265#52.100±12.233*54.700±5.208*0.333±0.031*0.004±0.001*0.336±0.017**RL/（cmH2O·s-1·mL-1）0.239±0.036 0.275±0.040#0.212±0.022**0.214±0.032**0.212±0.026**0.211±0.042**45.300±12.676**52.800±10.369*

3 討論

在中藥復方顆粒的制備過程中，提取是最為重要的環(huán)節(jié)，有效成分提取是否完全與其治療效果密切相關。由于中藥復方成分的復雜性，如何最大程度地提取其有效成分且盡可能地除去雜質及與治療作用無關的成分是篩選提取工藝的研究核心。同時，優(yōu)良的制備工藝也是減小使用劑量、提高臨床療效的基礎。中藥復方中的無效成分和雜質的分子量較大，在水中多以膠體的形式存在，不僅會影響中藥提取液的澄清度，也會增大藥物的服用量。水提醇沉法是中藥提取液制備中傳統(tǒng)的除雜方法，使有效成分提出的同時能達到精制的目的[11]。然而，采用全方水提醇沉工藝制備的中藥顆粒劑與全方水提工藝得到的顆粒劑在藥效上是否一致甚至治療效果是否更優(yōu)目前還未完全明確。因此，為探究不同工藝的芪蛭益肺顆粒對大鼠COPD的治療作用，本實驗采用煙熏復合氣道滴注LPS的方法復制大鼠COPD模型，比較不同工藝的芪蛭益肺顆粒對COPD模型大鼠的影響，為該藥物的臨床應用及新藥開發(fā)提供依據(jù)。

COPD患者的氣道疾病表現(xiàn)根據(jù)診斷和癥狀的不同分為慢性支氣管炎和支氣管擴張[12]，其主要特征是進行性的氣流受限[13]。判斷氣流受限的重復性較好的重要指標之一是肺功能檢查，其對COPD發(fā)病的早期明確診斷、病況嚴重程度綜合評價、疾病的治療效果等有著重要意義[1,14]。本實驗于第21 d上午給予氣道滴注LPS后，下午隨機取模型組和空白組各7只雄性大鼠進行了肺功能測定，結果表明，與空白組相比較，模型組大鼠MVV、FVC、FEV25-75%、FEV0.3/FVC%均顯著降低（P<0.05），表明其肺功能出現(xiàn)嚴重降低，證明COPD大鼠模型復制成功。

COPD患者的炎癥反應主要發(fā)生在氣道、肺及肺內血管中。參與炎癥反應的不僅有中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞，也有IL-8、IL-6、IL-17、TNF-α、可溶性細胞間黏附分子-1等細胞因子[15]。慢性炎癥反應是COPD的重要發(fā)生機制之一，可進一步導致氣道重塑，是COPD中氣流受限的重要因素之一[16]。本實驗中，分析HE染色結果可知，不同工藝的芪蛭益肺顆粒給藥干預后，COPD模型大鼠肺組織炎性細胞浸潤情況得到有效改善，表明芪蛭益肺顆粒能減輕COPD模型大鼠的慢性炎癥反應對氣道的反復刺激，抑制氣道重塑。杯狀細胞增生是COPD的重要臨床癥狀。在炎癥介質、顆粒刺激物等刺激因素作用下，杯狀細胞發(fā)生增生并可進一步分化為黏液分泌細胞，以維持氣道內平衡及氣道上皮的數(shù)量[17]。本實驗中通過AB-PAS染色結果可見，與模型組相比較，芪蛭益肺顆粒工藝1大、小劑量組、工藝2大、小劑量組可使COPD模型大鼠杯狀細胞數(shù)目顯著減少，說明給予芪蛭益肺顆粒具有抑制COPD模型組氣道杯狀細胞化生的作用。

本實驗通過藥效學對比研究發(fā)現(xiàn)，在給藥干預后，芪蛭益肺顆粒不同工藝大、小劑量組與模型組相比肺功能均出現(xiàn)很大程度改善，體現(xiàn)出芪蛭益肺顆粒對肺功能具有一定保護作用。但分析肺功能、肺指數(shù)及杯狀細胞數(shù)目數(shù)據(jù)結果不難發(fā)現(xiàn)，芪蛭益肺顆粒工藝2小劑量組在Cdyn、Re及肺指數(shù)方面與工藝1小劑量組相比改善效果更為顯著，且工藝2大劑量組氣道纖毛上杯狀細胞數(shù)目與工藝1大劑量相比減少得更為顯著，說明與工藝1相比，工藝2不但有治療作用且治療效果更優(yōu)。

綜上所述，芪蛭益肺顆粒全方水提及全方水提醇沉工藝對COPD模型大鼠均有一定的治療作用，但全方水提醇沉工藝得到的藥物在提取的同時起到了進一步精制的作用，且療效更佳，可使患者提高療效的同時服用更少藥量。因此，全方水提醇沉工藝得到的芪蛭益肺顆粒在新藥開發(fā)中更具優(yōu)勢。