中藥復(fù)方開心散調(diào)控慢性壓力應(yīng)激小鼠海馬炎性細(xì)胞因子水平抗抑郁作用機(jī)制研究＊

曲蘇晨，曹 程，戚明珠，劉夢秋，段金廒，朱 悅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化于方劑創(chuàng)新藥物國家地方地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 南京210029）

開心散始載于唐代孫思邈所著的《備急千金要方》，由人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓組成[1]。在長期的臨床實(shí)踐中，根據(jù)辨證論治的需要，開心散形成了多種配伍比例。尤以人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓配比為3∶2∶2∶3（D-652）、1∶1∶1∶2（K-984）、1∶1∶4∶8（K-1640）的比例應(yīng)用較多[2-3]。無論配伍比例如何變化，開心散均用以治療情志疾病證見心氣不足、憂愁悲傷、好忘等，這些癥狀與抑郁癥和阿爾茲海默癥的癥狀極為相似，故該方在現(xiàn)代常用于以上疾病的治療。

對于開心散抗抑郁機(jī)制的研究，過往報(bào)道多集中于神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子系統(tǒng)，而對其調(diào)控中樞神經(jīng)炎癥的效用和機(jī)制研究報(bào)道極少。因此，我們擬對開心散調(diào)控中樞炎性細(xì)胞因子水平抗抑郁效用及作用機(jī)制進(jìn)行研究，為進(jìn)一步闡明中藥復(fù)方開心散多靶點(diǎn)抗抑郁的科學(xué)內(nèi)涵提供更多現(xiàn)代科學(xué)解釋。

1 材料

1.1 動物

ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量22 g-25 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物許可證號SCXK（蘇）2018-0008。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF環(huán)境中，常規(guī)飼養(yǎng)，12 h光照，溫度22-25℃，濕度40%-70%。

1.2 藥物

人參（Panax ginsengC.A.Mey.）、遠(yuǎn)志（Polygala tenuifoliaWild.）、石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）、茯苓（Poriacocos（Schw.）Wolf）藥材飲片購自蘇州天靈中藥飲片公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定為相應(yīng)藥材。

1.3 試劑

小鼠ELISA檢測試劑盒LPS（JEB-12983）、IL-1β（JEB-12787）、IL-6（JEB-12267）、TNF-α（JEB-12474）均購自南京金益柏生物科技有限公司。TRIzol RNA（15596-026）購自美國Thermo Fisher公司。RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AE311）和SYBR熒光定量qPCR檢測試劑盒（AQ132）購自北京全式金生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用抗體NF-κB p65 Rabbit mAb、Phospho-NFκB p65 Rabbit mAb、Lamin B1 Rabbit mAb、Histone H3 Rabbit mAb、GAPDH Rabbit mAb，Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody，Anti-rabbit IgG（H+L）,F（ab′）2 Fragment（Alexa Fluor? 488 Conjugate）購 自CST公司 ，Anti Iba1 polyclonal antibody,Rabbit,for Immunocytochemistry購自日本W(wǎng)ako和光純藥公司。DAPI購自Sigma公司。

細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自以色列Biological Industries公司、耗材購自美國Corning公司。

1.4 儀器

凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；動物行為測試系統(tǒng)（上海吉量軟件公司）；qPCR儀（ABI7500，Life）；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（1300 series A2,Thermo Fisher Scientific公司）；多功能酶標(biāo)儀（Enspire，Perkin-Elmer公司）；AXIO Vert.A1熒光倒置顯微鏡（Zeiss公司）。

2 方法

2.1 開心散提取物的制備

按照人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓（3∶2∶2∶3）的配伍比例，稱取100 g藥材，采用8倍量的溶劑回流提取2次，每次2 h，過濾，合并二次提取液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到D-652凍干粉。使用前，按需復(fù)溶。更換配伍比例，同法制備K-984（1∶1∶1∶2）和K-1640（1∶1∶4∶8）提取物。

2.2 CUMS模型建立

所有小鼠適應(yīng)環(huán)境5天后，經(jīng)過曠場實(shí)驗(yàn)、基礎(chǔ)糖水消耗量與體重測定等測試后，綜合評分。選取評分相近的90只小鼠，其中隨機(jī)選取10只作為正常組，每籠5只飼養(yǎng)。其余小鼠進(jìn)行CUMS造模，均單籠孤養(yǎng)。CUMS模型建立方法的具體細(xì)節(jié)參考課題組已經(jīng)發(fā)表的成果[4]。

表1 動物實(shí)驗(yàn)給藥劑量

2.3 動物給藥

模型組動物待8周抑郁表型出現(xiàn)后，隨機(jī)分為8組，即空白組、CUMS組、D-652低、高劑量組、K-984低、高劑量組、K-1640低、高劑量組、氟西汀組。各給藥組劑量根據(jù)臨床人用劑量，按照體表面積折算為受試動物劑量。

2.4 行為學(xué)檢測

采用糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)考查小鼠的抑郁樣行為，實(shí)驗(yàn)的具體過程參照本課題組已經(jīng)發(fā)表過的成果[4]。

2.5 ELISA法測定海馬區(qū)中炎癥因子的表達(dá)

行為學(xué)測試結(jié)束后，處死小鼠，解剖獲得海馬組織，液氮迅速冷凍，粉碎。稱取相應(yīng)重量組織，加入10倍體積PBS，利用LPS、IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒，按試劑盒所列操作步驟，測定相應(yīng)因子的含量。試劑盒檢測范圍為20-500 pg/mL。

2.6 海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

行為學(xué)測試結(jié)束后，處死小鼠，解剖獲得小鼠全腦，常溫固定于4%PFA固定液中。常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片。小鼠腦片進(jìn)行二甲苯脫蠟處理，乙醇梯度脫水，于枸櫞酸鈉緩沖液中保持微沸狀態(tài)15 min，冷卻30 min，用3%過氧化氫脫氫處理。5% BSA+PBS-T（Triton）封閉1 h。一抗（Anti Iba1，1∶1000）4oC孵育過 夜。二 抗（Alexa 488 conjugate anti-rabbit IgG，1∶400）室溫避光孵育1 h，DAPI染核。封片，熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。運(yùn)用ZEN 2012（blue edition）圖像處理軟件系統(tǒng)分析。

2.7 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系（BV2）的培養(yǎng)基由下列組成：MEM-Eagle（88%）、胎牛血清（10%）、青霉素/鏈霉素（1%）、丙酮酸鈉溶液（1%）。每48 h換液一次，待細(xì)胞密度為70%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以傳代培養(yǎng)三代后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.8 實(shí)時(shí)定量熒光PCR法測定神經(jīng)營養(yǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)

取BV2細(xì)胞樣品，按TRIzol RNA提取試劑盒所列步驟進(jìn)RNA提取，依據(jù)Transgen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作獲得cDNA。然后依照SYBR熒光實(shí)時(shí)定量試劑盒操作步驟，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀測定神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。所用引物序列見表2?；虻谋磉_(dá)量用2-??Ct計(jì)算，設(shè)置GAPDH為內(nèi)參基因。以正常組對照組樣本為對照樣本，設(shè)為100%，計(jì)算其余各組的基因表達(dá)差異。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

2.9 蛋白免疫印跡法

細(xì)胞末次給藥24 h后，采用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，或根據(jù)碧云天胞漿/胞核蛋白抽提試劑盒分別提取胞漿蛋白和核蛋白，按照BCA試劑盒的方法測定總蛋白濃度，98℃，5 min高溫變性。按照Western Blotting法的實(shí)驗(yàn)步驟，制備7.5%的聚丙烯酰胺凝膠，上樣后90 V電泳2 h，300 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%BSA封閉，一抗（NF-κB p65 RabbitmAb、Phospho-NFκB p65Rabbit mAb、Lamin B1Rabbit mAb、Histone H3Rabbit mAb、GAPDHRabbit mAb），抗 體 比 例1∶3000。4℃過夜，孵育二抗（Anti-rabbit IgG,HRPlinked Antibody），二抗比例1∶5000，室溫50 min。ECL試劑盒顯色。

2.1 0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與數(shù)據(jù)表示

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05，有差異；P<0.01，有極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 開心散提取物抗抑郁效用評價(jià)

給藥10日后，進(jìn)行糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)行為學(xué)的測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組糖水偏嗜率較空白組顯著降低（P<0.01），強(qiáng)迫游泳與懸尾不動時(shí)間較空白組顯著增加（P<0.05）；給藥組與模型組相比，開心散各提取物具有上調(diào)模型動物糖水偏嗜率和下調(diào)其強(qiáng)迫游泳、懸尾不動時(shí)間的作用趨勢。開心散提取物三個比例給藥組比較，并未見顯著性差異，但以D-652高劑量減輕動物抑郁樣行為的作用趨勢最強(qiáng)，其作用趨勢與陽性藥氟西汀相當(dāng),（結(jié)果見圖1）。

圖1 開心散不同配伍比例對CUMS模型小鼠行為學(xué)的影響（n=10）

3.2 開心散提取物對小鼠海馬炎癥因子表達(dá)的影響

分離并獲取受試動物海馬組織，采用ELISA法檢測海馬中LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型動物海馬區(qū)LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平較空白組顯著上調(diào)（P<0.01），開心散各配伍比例均能顯著下調(diào)模型動物海馬區(qū)中LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)（與模型組相比，P<0.05），各比例間比較，未見顯著性差異，D-652高劑量組顯示出較強(qiáng)的作用趨勢（結(jié)果見圖2）。

圖2 開心散不同配伍比例對CUMS模型動物海馬區(qū)中促炎物質(zhì)表達(dá)的影響（n=10）

3.3 開心散提取物對小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

分離并獲取受試動物全腦，利用免疫組化技術(shù)標(biāo)記受試動物海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞生物標(biāo)記物Iba1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞多呈分枝狀的未激活狀態(tài)；CUMS組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞成圓形狀態(tài)，提示被激活。給以開心散D-652高劑量后，小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)接近空白組，提示開心散給藥可抑制慢性壓力激活小膠質(zhì)細(xì)胞（結(jié)果見圖3）。

圖3 小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（n=3）

3.4 開心散D-652配伍比例對BV2細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

我們采用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系（BV2），加以LPS刺激炎癥因子產(chǎn)生，構(gòu)建體外中樞神經(jīng)炎癥因子表達(dá)模型，進(jìn)一步探索開心散降低海馬區(qū)中炎癥因子表達(dá)水平的作用機(jī)制。

首先，考察了不同濃度LPS對BV2細(xì)胞中炎性因子表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)1μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)LPS可顯著促進(jìn)BV2細(xì)胞內(nèi)炎癥因子表達(dá)（結(jié)果見圖4）。

圖4 不同濃度的LPS對BV2細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（n=9）

其次，在1～10μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，開心散各配伍比例不會促進(jìn)BV2細(xì)胞表達(dá)炎癥因子（結(jié)果見圖5）。

圖5 開心散不同配伍比例對BV2細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（n=9）

將開心散各配伍比例提取物與LPS（1μg·mL-1）共同加至BV2細(xì)胞作用48 h后，檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，LPS顯著促進(jìn)了炎癥因子的表達(dá)，提示造模成功。與LPS給藥組相比，開心散各配伍比例提取物的中劑量與高劑量顯著下調(diào)了IL-1β、IL-6與TNF-α的表達(dá)（與LPS組相比，P<0.05）。各配伍比例中，以D-652高濃度組（10μg·mL-1）下調(diào)IL-6的效用最強(qiáng)，與比例K-984和K-1640的高劑量組比較，存在顯著性差異（P<0.05）；在下調(diào)與TNF-α表達(dá)方面，三個比例沒有顯著性差異。D-652高劑量組下調(diào)IL-1β表達(dá)的作用趨勢更強(qiáng)，而K-1640高劑量組下調(diào)TNF-α表達(dá)的作用趨勢更強(qiáng)。（結(jié)果見圖6）。

3.5 開心散D-652配伍比例對NF-κB信號通路的影響

依據(jù)上述體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選取開心散D-652配伍比例，進(jìn)一步對BV2細(xì)胞中NF-κB的入核與磷酸化情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，LPS的作用使得胞漿內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平降低，胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平提高，且核內(nèi)NF-κB的磷酸化水平提高，提示LPS可以促進(jìn)NF-κB入核并激活NF-κB磷酸化（與空白組相比，P<0.05）。而D-652能夠削弱LPS的作用趨勢，抑制NF-κB的入核過程，且降低NF-κB的磷酸化水平（與LPS組相比，P<0.05）（結(jié)果見圖7）。

4 討論

抑郁癥是一種以長期的心情壓抑，憂愁悲傷為主要特征的情志疾病。其發(fā)病過程極為復(fù)雜，也提出了神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、神經(jīng)生長障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂等多種發(fā)病假說。僅針對單一環(huán)節(jié)起效的抑郁癥治療藥物可能無法適應(yīng)這一復(fù)雜疾病的治療需要，目前常用的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)重?cái)z取抑制劑對30%的病人無效的臨床事實(shí)也充分說明了這一點(diǎn)[4-5]。

圖6 開心散不同配伍比例對LPS激活狀態(tài)的BV2細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（n=9）

圖7 開心散D-652配伍比例對LPS激活狀態(tài)下的BV2細(xì)胞中NF-κB信號通路的影響（n=3）

目前，中樞神經(jīng)炎癥已被認(rèn)為是抑郁癥病理發(fā)生發(fā)展的重要作用環(huán)節(jié)。臨床發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNFα水平顯著高于正常人。動物研究亦證實(shí)，持續(xù)的慢性壓力應(yīng)激激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，不僅激活色氨酸犬尿酸合成代謝通路導(dǎo)致5-羥色胺合成減少，還可以直接損傷神經(jīng)元的存活及其發(fā)育，使抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的趨化因子CX3CL1釋放減少，小膠質(zhì)細(xì)胞更易被激活，過度分泌促炎因子，構(gòu)成惡性循環(huán)。NF-κB信號通路是促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞炎癥因子的重要信號通路，LPS是該信號通路的重要誘導(dǎo)因子。LPS作用于小膠質(zhì)細(xì)胞的Toll樣受體，促使胞漿中NF-κB進(jìn)入胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的合成與分泌[6,7]。因此，抑制腦中炎性細(xì)胞因子水平，減輕神經(jīng)元炎性損傷已成為抑郁癥治療藥物的重要開發(fā)靶點(diǎn)。

開心散是輕、中度抑郁癥的有效治療方劑[8]。中醫(yī)理論認(rèn)為，抑郁一證，多因七情損傷，氣機(jī)失和，漸致臟腑氣血陰陽失調(diào)而形成。腦為元神之府，心腦共主神明。心氣不足，無力推動氣血精津上榮于腦。倘受七情內(nèi)傷，或外感濕邪，漸成痰飲水濕清竅蒙蔽，濁陰蔽阻元神，故見憂愁悲傷不樂，好忘，眩暈諸證。該證按臟腑辨證，病在心系。按八綱及氣血津液辨證，為心氣虛損，濕濁蔽阻的虛實(shí)并見，虛中夾濕。故治法當(dāng)以補(bǔ)氣強(qiáng)心以補(bǔ)心氣虛損，開竅化濕以清痰濕蒙蔽。方中用人參大補(bǔ)心氣，鼓動氣血上榮于腦，使腦得陽氣溫煦與陰血滋養(yǎng)。遠(yuǎn)志開心氣寧心安神，兼豁痰利竅以泄?jié)?。石菖蒲開竅化濕，茯苓淡滲利水，使痰濕得化，不復(fù)上僭。四藥共享，共奏補(bǔ)心安神，開心益智之功[9]。諸多現(xiàn)代研究證實(shí)，開心散可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、促進(jìn)神經(jīng)突觸生長等多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁與增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的效用，但是，開心散抑制中樞神經(jīng)炎癥抗抑郁的研究報(bào)道卻較為少見[10-13]。而其他研究發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷與人參皂苷Rg3等，可抑制慢性壓力應(yīng)激抑郁大鼠HPA軸激活，降低海馬中IL-1β、IL-6與TNF-α的水平，并通過抑制色氨酸代謝為犬尿酸來提高海馬區(qū)5-羥色胺水平[14-15]。而人參正是開心散的組成藥味，并且開心散全方不僅可顯著促進(jìn)人參皂苷溶出，還可促進(jìn)人參皂苷進(jìn)入中樞發(fā)揮作用[11-12]。本研究中，我們的確發(fā)現(xiàn)，抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)也是開心散抗抑郁效用發(fā)揮的重要方式，各個比例均表現(xiàn)出抑制炎性因子表達(dá)的效用，未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但人參與遠(yuǎn)志含量較高的D-652配伍比例作用趨勢最明顯。因此，我們將對開心散調(diào)控中樞神經(jīng)炎癥的功效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深入的研究，全面揭示開心散抗抑郁的作用環(huán)節(jié)與抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)。