成都市市售即食食品中克羅諾桿菌的分離鑒定及藥敏檢測

羅夢幽，賀蘇皖，白鳳嵐，曾寶鋒，代義闖，唐俊妮

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌，屬于腸桿科，是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1].克羅諾桿菌屬于嬰兒配方乳粉中的A類致病菌，會導(dǎo)致腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎以及新生兒敗血癥[2-3].盡管使用抗生素治療可以康復(fù)，但會伴隨嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、發(fā)育障礙等癥狀，死亡率高達50～80%[4].

克羅諾桿菌屬的來源非常廣泛，存在于環(huán)境、植物以及各種食品中.其中，嬰兒配方奶粉是新生兒感染克羅諾桿菌的主要途徑.Iversen[5]等調(diào)查了82種嬰兒配方奶粉和404種其他食品中克羅諾桿菌和其他腸桿菌科細(xì)菌的存在情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嬰兒配方奶粉、干酪產(chǎn)品中均檢出克羅諾桿菌，未檢出沙門氏菌和其它腸桿菌，說明傳統(tǒng)控制沙門氏菌和其它腸桿菌的方法并不能有效控制克羅諾桿菌，且克羅諾桿菌在食品中來源十分廣泛.該菌已被國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會列入“對特定人群產(chǎn)生嚴(yán)重的生命危害、或產(chǎn)生慢性后遺癥”的微生物，與肉毒梭菌的A、B型毒素、單核細(xì)胞增生李斯特菌等具有同等的危害[6].

克羅諾桿菌致病性與其侵襲性毒素有關(guān)，其產(chǎn)生的外膜蛋白A(OmpA)是主要的毒力因子，以往使用的分子檢測靶點基因主要包括ompA和16S rRNA等[7-9].由于16S rRNA的特異性不強且多樣性不豐富，很難將待鑒定的微生物精確到種的水平[10-11].曲春波[9]利用編碼DNA促旋酶B亞基(拓?fù)洚悩?gòu)酶型Ⅱ)的一個功能保守的看家基因gyrB檢測克羅諾桿菌屬菌株具有很好的特異性，并證實gyrB基因可作為克羅諾桿菌屬菌株一個新的分子識別標(biāo)記[12].另外，近年來隨著克羅諾桿菌耐藥性的報道不斷增加，有關(guān)該菌的耐藥性問題也越來越引起重視[13-16].

因此，本研究針對成都市武侯區(qū)市售食品中克羅諾桿菌的分布及污染進行初步調(diào)查，同時對克羅諾桿菌分離菌株進行藥敏檢測，為治療克羅諾桿菌引起的相關(guān)疾病提供參考.

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基、試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、阪崎克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基(DFI)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)(杭州微生物試劑有限公司)；Mueller-Hinton瓊脂(MHA)、緩沖蛋白胨水(BPW緩沖液)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(mLST-Vm)(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；REGULARAGAROSEG-10瓊脂糖BIOWEST公司；GELVIEW核酸染料、DL2000 Marker、PCR 引物、25 mmol/L MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；各種藥片(賽默飛世爾科技(中國)有限公司).

1.2 儀器與設(shè)備

WD800B型微波爐(順德市格蘭仕微波爐電器有限公司)；5804R型Eppendorf冷凍離心機(Eppendorf中國有限公司)；PTC-200 PCR儀、Universal Hood II型凝膠成像儀(Bio-Rad公司)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；UV-6100分光光度計(上海美普達儀器有限公司)；GHP-9080水式恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱(江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠)；AKHL-III-24艾柯超純水機(臺灣艾柯)(成都康寧實驗專用純水設(shè)備)；MLS-3020電熱自動滅菌鍋(日本SANYO公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠).

1.3 實驗方法

1.3.1 食品樣本采集

從成都武侯區(qū)周邊超市、農(nóng)貿(mào)市場和路邊食品攤店等采集不同種類的即食食品共計100份(樣品種類及其數(shù)量詳見圖1).當(dāng)日采集的樣品立即送入實驗室進行細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定，采樣時間為2015年7月至2015年11月.

1.3.2 克羅諾桿菌的分離與純化

所有的樣品均在無菌條件下進行處理.按照GB 4789.40-2016進行檢驗[17].取檢樣5 g加入BPW稀釋液45 mL，37℃下震蕩培養(yǎng)18 h；取1 mL上述菌懸液加入改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(mLST-Vm，10 μg/mL)，置于恒溫培養(yǎng)箱中 44 ℃，24 h恒溫培養(yǎng)；將上述菌懸液接種至DFI顯色培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)22～26 h，疑似菌落在顯色培養(yǎng)基上呈圓形、藍(lán)綠色菌落形態(tài)；每板挑取1～3個疑似菌落接種至TSA瓊脂平板25℃下培養(yǎng)48 h；將在顯色平板上呈藍(lán)綠色且能在TSA平板上能生成黃色的疑似菌株進一步純化培養(yǎng)和進行分子鑒定.

圖1 采集的食品種類及數(shù)量Fig.1 The type and numbers of food samples

1.3.3 克羅諾桿菌的16S rDNA測序鑒定及gyrB基因檢測

將純化后的菌株接種至TSB肉湯中，37℃培養(yǎng)16～18 h，用微波加熱法[18]提取分離菌株的DNA，以細(xì)菌通用引物16S rDNA及看家基因gyrB引物對其進行PCR擴增.檢測基因的引物序列、擴增片段長度及退火溫度見表1.PCR反應(yīng)總體系為20 μL，上下游引物各 0.5 μL，DNA 模版 1 μL，10 × PCR buffer(Mg2+free)2 μL，，25 mM 的 Mg Cl21.6 μL，dNTP Mixture 1.2 μL，Taq 酶 0.2 μL，剩下由無菌去離子水補齊.PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.取4.5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄結(jié)果.將擴增的16S rDNA產(chǎn)物送至成都擎科生物公司進行測序比對.

表1 本研究所用引物序列Table 1 The primers used in this study

1.3.4 克羅諾桿菌藥敏檢測

根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的K-B紙片擴散法進行操作，從TSA瓊脂培養(yǎng)基上挑取單菌落至無菌生理鹽水中調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，用無菌棉簽蘸取適量菌懸液均勻涂于MH瓊脂表面，接種15 min內(nèi)用鑷子將藥敏試紙片放置在已接種的MH平板上，每個平板放置4個試紙片.將平板置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～18 h后取出，用直尺測量抑菌環(huán)直徑.試驗結(jié)果按照CLSI的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行判定.共選擇了12大類16種抗生素，具體見表2.

表2 抗菌藥物種類及藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The antibacterial drugs and the drug sensitivity evaluation criteria

(續(xù)表2)

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

藥敏實驗平行重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±SD表示，使用軟件SPSS 19.0統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 克羅諾桿菌的分離、純化與鑒定結(jié)果

依據(jù)GB4789.40-2016《食品微生物學(xué)檢驗阪崎腸桿菌檢驗》對各類食品中的克羅諾桿菌進行分離.挑選顯色平板上呈藍(lán)綠色且能在TSA平板上能生成黃色的菌株.純化的菌落在DFI顯色培養(yǎng)基上的形態(tài)特征見圖2，通過形態(tài)學(xué)鑒定得到32株克羅諾桿菌疑似分離菌株.將分離菌株進行16S rDNA通用引物PCR擴增見圖3，16S rDNA測序比對證實32株分離菌株均為克羅諾桿菌屬.進一步利用管家基因gyrB對32株克羅諾分離菌株進行檢測，部分檢測結(jié)果見圖4，所有32株分離菌株均檢測出gyrB基因，從另一個側(cè)面證實管家基因gyrB對克羅諾桿菌檢測具有較好的特異性.

圖2 分離菌株在DFI顯色培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology of Cronobacter spp.on DFI medium

圖3 16S rDNA基因檢測結(jié)果Fig.3 The PCR results for 16S rDNA gene in Cronobacter spp.isolates

圖4 菌株的gyrB基因檢測結(jié)果Fig.4 The PCR results of gyrB gene in Cronobacter spp.isolates

通過上述鑒定，本研究從100份即食食品樣品中，分離獲得32株克羅諾桿菌，樣品的分離率為32%.

本研究中從武侯區(qū)周邊超市共采集樣品45份，有11份樣品分離出克羅諾桿菌，分離率為24.4%；從武侯區(qū)周邊食品小吃店共采樣51份，有21份樣品分離出克羅諾桿菌，分離率為41.2%；從周邊農(nóng)貿(mào)市場采樣4份，未分離出克羅諾桿菌.

進一步對采樣樣品種類進行分析，涼拌即食蔬菜類44份中檢出17份，檢出率為38.64%；熟肉、內(nèi)臟及其制品采樣35份中檢出8份，檢出率為22.86%；即食豆制品采樣16份，檢出6份，檢出率為37.5%；即食米面制品采樣3份，檢出1份，檢出率為33.33%(見圖5).其中，涼拌菜的污染最為嚴(yán)重.

圖5 不同種類食品中克羅諾桿菌的檢出率Fig.5 The detection rates of Cronobacter spp.in different foods

2.2 克羅諾桿菌分離菌株的藥敏檢測結(jié)果

分離菌株的藥敏檢測結(jié)果見表3，克羅諾桿菌32株分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氯霉素、頭孢西丁、甲氧芐啶及氨曲南等10種抗生素完全敏感；對萬古霉素和克林霉素兩種抗生素完全耐藥；對紅霉素、氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率分別為9.38%、6.25%、6.25%；對紅霉素、氨芐西林、亞胺培南和四環(huán)素的中介率分別為90.62%、40.63%、3.13%和3.13%.本研究中分離的克羅諾桿菌尚未出現(xiàn)多重耐藥情況.

表3 克羅諾桿菌分離菌株對16種抗菌藥物的藥敏檢測結(jié)果Table 3 The antimicrobial susceptibility of Cronobacter spp.isolates to 16 antibiotics

3 討論

克羅諾桿菌在環(huán)境中廣泛分布，在嬰幼兒奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶葉、草藥、調(diào)味料及豆腐等多種食品中被檢測到，即使有微量污染，該菌在室溫下也會大量繁殖[19-20].李遠(yuǎn)宏[21]等在食品香辛料和調(diào)味料等64份樣品中檢出19份樣品含有克羅諾桿菌，檢出率為29.7%.王倩寧[22]等對羊奶粉加工廠的環(huán)境和產(chǎn)品進行采樣，180份樣品中有29份檢出阪崎腸桿菌，污染率為16.1%.本研究中，我們從成都市武侯區(qū)周邊超市和食品攤點采集的食品樣本中分離出32株克羅諾桿菌，樣品的分離率為32%.其中，米面制品的檢出率低于姜探璐[22]等在營養(yǎng)面條中對克羅諾桿菌的檢出率(71.4%).黃啟紅[23]等對豆制品的檢出率為100%(2/2)，而本研究中豆制品的檢出率為37.5%(6/16)，這可能是前者采樣基數(shù)較小的原因.從我們的研究結(jié)果來看，涼拌菜中的污染較大，涼拌菜的污染大多來自加工和販賣過程，夏季天氣炎熱，為細(xì)菌的繁殖提供了有利的條件，有關(guān)部門應(yīng)加強對食品中克羅諾桿菌污染的監(jiān)督.

本研究中，32株克羅諾分離菌株均檢測出gyrB基因，我們的研究結(jié)果與曲春波[9]、陳萬義[12]等的結(jié)果具有一致性，證實了管家基因gyrB具有良好的特異性，可作為克羅諾桿菌檢測的一個分子標(biāo)識.

近年來，細(xì)菌的耐藥性不斷增加，給臨床治療帶來諸多困難[24].黃玉蘭等[25]針對四川省市售嬰幼兒奶粉、嬰幼兒谷物輔助食品及臨床病例中分離的克羅諾桿菌藥敏進行檢測，109株克羅諾桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、頭孢噻肟、慶大霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、四環(huán)素等7種抗生素均敏感.王倩寧[21]等對羊奶粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離的阪崎腸桿菌進行藥敏檢測，發(fā)現(xiàn)29株阪崎腸桿菌分離菌株對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素類抗生素均敏感.張西萌[26]等對進口乳制品中的克羅諾桿菌分離株進行藥敏檢測，發(fā)現(xiàn)100株克羅諾桿菌分離菌株對慶大霉素、阿米卡星、氯霉素、頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星等14種抗生素敏感，對四環(huán)素、氨芐西林表現(xiàn)出不同程度的耐藥.裴曉燕[27]等對中國嬰幼兒配方奶粉中分離的阪崎腸桿菌進行藥敏分析，發(fā)現(xiàn)所有菌株對頭孢他啶、亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氯霉素等抗生素敏感，對萬古霉素耐藥.本研究中，32株克羅諾桿菌分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氯霉素、頭孢西丁、甲氧芐啶及氨曲南等10種抗生素均敏感，對克林霉素和萬古霉素耐藥率為100%，對紅霉素、氨芐西林和四環(huán)素有不同程度耐藥.我們的研究結(jié)果與上述報道具有一致性.但以上報道中發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌出現(xiàn)多重耐藥情況，本研究中尚未發(fā)現(xiàn).

綜上，本研究針對成都市武侯區(qū)周邊超市、食品小吃店和農(nóng)貿(mào)市場的食品樣品進行采樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同樣品中存在一定程度的克羅諾桿菌污染，并且分離菌株存在一定的耐藥性，與其他研究相比較，即食食品中克諾羅桿菌的耐藥性并不高.本研究結(jié)果為成都市市售食品中克羅諾桿菌污染評價提供參考.