匹伐他汀對2型糖尿病模型大鼠腎臟損傷的保護機制

田 靜，李 影，劉 芳

(保定市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，保定 071000)

在高血糖狀態(tài)下，氧化應激是血管內(nèi)皮功能障礙的原因之一。血糖控制達標可減慢糖尿病腎病(DN)的進展[1-2]。DN可能是一種炎性因子介導的炎癥反應：炎性細胞釋放炎癥因子，炎癥因子促進炎癥細胞的黏附、聚集和激活，兩者互為因果[3]。他汀類藥物能改善患者內(nèi)皮細胞功能，對炎癥細胞的黏附、聚集有抑制作用。本課題通過建立STZ誘導的糖尿病大鼠模型，觀察在高脂飼料喂養(yǎng)狀態(tài)下炎癥因子及氧化應激相關(guān)指標的動態(tài)變化，探討匹伐他汀對上述指標的影響及可能的作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 SCR20B型離心機(日本HITACHI公司)；LEICARM 2016石蠟切片機(上海五相儀器儀表有限公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Q55OCW圖像信號采集與分析系統(tǒng)(德國LEICA 公司)。

1.2試藥 匹伐他汀(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號160422)；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號090412)；大鼠IL-6、VEGF免疫試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號分別為100042和100173)；大鼠MDA、SOD、GSH-PX(南京建成生物工程研究所，批號分別為20140117，20140115和20140109)。

1.3實驗動物 健康雄性Wistar大鼠84只，體質(zhì)量為110±10 g，均由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院動物實驗中心提供(動物合格證編號908040)。

2 實驗方法

2.1DM大鼠造模與分組 應用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組16只、模型組68只。各組大鼠適應性喂養(yǎng)1周，模型組大鼠均給予40 mg·kg-1鏈脲佐菌素腹腔注射，72 h后尾靜脈采血測定血糖。血糖高于16.7 mmol·L-1為糖尿病模型造模成功。將造模成功的64只大鼠隨機分為糖尿病低脂組、糖尿病低脂干預組、糖尿病高脂組和糖尿病高脂干預組,各16只。2個低脂組大鼠先給予普通飼料喂養(yǎng)8周，然后糖尿病低脂干預組大鼠給予匹伐他汀2 mg·kg-1灌胃，每日1次，糖尿病低脂組給予等量的生理鹽水灌胃，共3周；2個高脂組大鼠先給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，然后糖尿病高脂干預組大鼠給予匹伐他汀2 mg·kg-1灌胃，每日1次，糖尿病高脂組給予等量的生理鹽水灌胃，共3周。

2.2各項指標監(jiān)測 每周監(jiān)測各組大鼠體質(zhì)量。實驗性喂養(yǎng)前和喂養(yǎng)12周后，各組大鼠經(jīng)尾靜脈取血測定血脂、空腹血糖(FBG)、血游離脂肪酸(FFA)、血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。血漿葡萄糖和血脂指標等均采用相應酶法測定。

2.3尿蛋白檢測 各組大鼠喂養(yǎng)12周后，收集大鼠24 h尿液，檢測24 h尿蛋白含量。

2.4IL-6和VEGF的含量測定 各組大鼠喂養(yǎng)12周后，禁食10 h，給予體積分數(shù)為10%的水合氯醛腹腔麻醉，剖腹，腎靜脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa法)測定血中IL-6和VEGF的含量。

2.5腎組織勻漿丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量測定 應用空氣栓塞法處死大鼠，測定大鼠單腎質(zhì)量，計算腎肥大指數(shù)(腎肥大指數(shù)=單腎質(zhì)量÷體質(zhì)量)。取適量腎臟組織，用冰生理鹽水清洗，清凈后制成體積分數(shù)為10%的腎組織勻漿。測定腎組織勻漿中MDA、SOD和GSH-PX的含量。

2.6觀察腎組織病理改變 部分腎組織依次經(jīng)固定、脫水、包埋、切片等一系列步驟后，制成HE染色組織切片，置于光鏡下觀察腎臟病變情況。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠的體質(zhì)量、腎肥大指數(shù) 實驗前，比較各組大鼠體質(zhì)量，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠體質(zhì)量明顯高于其余各組大鼠，且糖尿病高脂組高于糖尿病高脂干預組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。飼養(yǎng)12周后，糖尿病模型組大鼠腎臟肥大指數(shù)明顯高于正常對照組，而匹伐他汀干預組大鼠的腎臟肥大指數(shù)較匹伐他汀未干預組明顯降低(P<0.05)。提示匹伐他汀可明顯減輕糖尿病大鼠腎臟肥大的程度。見表1。

表1各組大鼠體質(zhì)量和腎肥大指數(shù)

組別體質(zhì)量/g0周 12周 單腎質(zhì)量/g腎肥大指數(shù)正常對照組105.74±11.34263.01±15.54 2.300 6±0.202▲ 0.853±0.06糖尿病低脂組106.68±9.41238.93±18.86?▲ 2.452 8±0.176 0.993±0.08?▲糖尿病低脂干預組106.09±9.92264.59±13.44 2.497 3±0.249? 0.930±0.07?糖尿病高脂組106.76±10.10352.69±16.38?▲ 3.284 4±0.284▲? 0.929±0.06?糖尿病高脂干預組106.39±11.12325.09±13.65? 2.879 8±0.239? 0.874±0.07

注:與正常對照組比較*P<0．05，差異具有統(tǒng)計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異具有統(tǒng)計學意義。

3.2血脂、游離脂肪酸檢測結(jié)果 高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠血脂各項指標明顯高于正常對照組和2個低脂組，給予匹伐他汀處理后，糖尿病高脂組大鼠血脂指標明顯降低(P<0.05)；說明匹伐他汀有明顯的降脂作用。見表2。

3.3血糖結(jié)果 糖尿病模型組大鼠經(jīng)過12周的高脂飼料喂養(yǎng)后，F(xiàn)BG進一步升高。表明匹伐他汀對血糖無明顯影響(P<0.05)。見表2。

表212周后各組大鼠的TC、TG、LDLC、FBG和FFA

組別TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDLC/mmol·L-1FBG/mmol·L-1FFA/mmol·L-1正常對照組1.57±0.12▲0.62±0.100.98±0.125.13±0.81▲1.23±0.10▲糖尿病低脂組1.69±0.38▲0.62±0.161.03±0.2018.99±1.94?1.16±0.23▲糖尿病低脂干預組1.03±0.290.54±0.150.71±0.1817.96±1.34?1.00±0.22?糖尿病高脂組8.00±0.98?▲1.39±0.10?▲6.11±0.87?▲21.58±2.30?▲2.05±0.18?▲糖尿病高脂干預組5.53±0.90?0.92±0.19?3.53±0.71?20.10±1.77?1.42±0.16?

注：與正常對照組比較*P<0．05，差異具有統(tǒng)計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異具有統(tǒng)計學意義。

3.4各組大鼠血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量測定結(jié)果 長期高血糖狀態(tài)下糖尿病高脂組大鼠24 h尿蛋白含量明顯高于正常對照組(P<0.05)，血肌酐和尿素氮含量也明顯偏高，進一步加重了糖尿病大鼠的腎臟損傷；經(jīng)匹伐他汀處理后24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮均有所降低，在一定程度上減輕了糖尿病大鼠的腎臟損傷(P<0.05)。見表3。

3.5各組大鼠血IL-6和VEGF水平 與正常對照組比較，糖尿病模型組血IL-6和VEGF含量明顯偏高(P<0.05)，高脂環(huán)境下IL-6和VEGF進一步增高(P<0.05)。糖尿病大鼠腎臟中炎癥因子增多，高脂環(huán)境進一步加重了局部的炎癥反應，本研究結(jié)果提示匹伐他汀可能具有一定的抗炎作用。見表4。

3.6各組大鼠腎組織勻漿MDA、SOD和GSH-PX含量測定 比較不同飼養(yǎng)條件下糖尿病模型組大鼠的腎臟MDA、SOD和GSH-PX含量，研究提示，長期高糖、高脂環(huán)境下糖尿病模型組大鼠腎臟氧化應激反應明顯增強(P<0.05)。匹伐他汀可部分降低氧化應激的程度，通過抑制局部氧化應激反應起到保護腎臟的作用。見表4。

表3各組大鼠血肌酐、尿素、24h尿蛋白測定結(jié)果

組別血肌酐/μmol·L-1尿素氮/mmol·L-124 h尿蛋白/g·L-1正常對照組56.45±8.57 6.01±0.8313.95±1.53▲糖尿病低脂組58.39±8.35 5.94±0.8441.80±7.40▲?糖尿病低脂干預組54.55±8.58 5.86±0.7732.39±5.34?糖尿病高脂組99.09±11.61▲?12.24±1.28▲?90.88±10.58▲?糖尿病高脂干預組77.20±9.72? 9.96±1.14?60.92±8.31?

注：與正常對照組比較*P<0．05，差異有統(tǒng)計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異有統(tǒng)計學意義。

表4大鼠血IL-6、VEGF水平及腎組織勻漿MDA、SOD和GSH-PX含量

組別IL-6/ng·L-1VEGF/ng·L-1MDA/nmol·g-1SOD/U·mg-1GSH-PX(活力單位)正常對照組 66.75±8.36▲19.33±2.52▲13.23±1.54▲208.08±25.45▲316.98±23.04▲糖尿病低脂組 93.17±12.52▲?29.14±2.89▲?19.24±1.50▲?160.64±15.2▲?254.61±18.38▲?糖尿病低脂干預組 81.15±10.92?24.69±2.59?16.61±1.35?182.86±14.91?296.91±21.25?糖尿病高脂組163.86±12.7▲?46.09±3.88▲?24.17±2.34▲?128.35±14.6▲?207.83±18.32▲?糖尿病高脂干預組116.67±15.78?37.97±3.04?19.78±1.77?146.86±15.48?232.42±19.61?

注:與正常對照組比較*P<0．05，差異具有統(tǒng)計學意義；與匹伐他汀干預組比較▲P<0．05，差異具有統(tǒng)計學意義。

3.7各組大鼠腎臟組織形態(tài)學比較 與正常對照組大鼠比較，糖尿病低脂組大鼠腎小球可見輕度炎細胞浸潤及纖維化；高脂組腎臟病變進一步加重，除了腎小球，腎間質(zhì)亦可見明顯炎癥細胞浸潤、纖維化。匹伐他汀干預后上述病變程度均較干預前減輕。從病理形態(tài)上進一步說明匹伐他汀可減輕糖尿病大鼠腎臟的免疫炎癥反應，從而在一定程度上延緩糖尿病腎病的進展。見圖1。

圖1大鼠腎組織形態(tài)學比較

A.正常對照組(×100)； B.糖尿病低脂干預組(×400)；C.糖尿病低脂組(無匹伐他汀處理,×100)；D.糖尿病高脂干預組(×400);E.糖尿病高脂組(無匹伐他汀處理,×400)。

Fig.1 Comparison of morphology of kidney in rats

A.blank control group (×100)；B.pitavastatin group fed by low dose fat (×400)；C.group fed by low dose fat (fed by normal fat and untreated by pitavastatin,×100)；D.pitavastatin group fed by high dose fat (×400)；E.group fed by high dose fat (fed by high dose fat and untreated by pitavastatin,×400).

4 討論

由炎癥細胞、細胞因子參與的一系列炎癥反應已成為DN發(fā)生、發(fā)展的重要原因[4-5]。IL-6與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。IL-6使DN患者系膜細胞局部氧自由基的生成增多、加重脂質(zhì)過氧化、損傷細胞內(nèi)膜；IL-6和TNF-α均可促進免疫復合物的形成，并沉積于腎臟血管內(nèi)皮形成血栓[6-8]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是體內(nèi)一種強效促血管生成因子，可使血管內(nèi)皮的通透性增加。有學者發(fā)現(xiàn)，VEGF表達的上調(diào)可加重糖尿病腎臟病變[9]。許多炎癥因子相互作用導致免疫失衡，腎臟病變進一步加重[10-12]。多項臨床研究證實了上述觀點[13-14]。

文獻表明，他汀類藥物有抗炎、減輕腎小球硬化和保護腎功能等作用[15-18]。DN早期存在腎小球肥大，可伴有腎小管間質(zhì)纖維化，晚期可出現(xiàn)腎小球硬化和腎功能衰竭。核因子-κB(NF-κB)可調(diào)節(jié)多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[19]。他汀類藥物能抑制巨噬細胞的浸潤和某些炎性因子如TGF-B1和IL-6等的表達，NF-κB的活性受抑，減輕腎臟局部的炎癥反應。

STZ是最常用的致糖尿病藥物，此類藥小劑量腹腔注射，可部分損傷胰島β細胞，使胰島素分泌減少[20-21]；高脂高糖喂養(yǎng)可誘導實驗動物出現(xiàn)胰島素抵抗[22]，2種方法結(jié)合更易獲得2型糖尿病動物模型。研究表明，STZ對肝、腎有一定的毒性[23]。研究提示，STZ誘導的糖尿病大鼠血循環(huán)中IL-6和VEGF水平較普通飼料喂養(yǎng)的模型大鼠明顯升高。經(jīng)匹伐他汀處理后，除了糖尿病大鼠血循環(huán)中炎癥因子的水平下降外，腎組織勻漿中的MDA水平也有所降低，GSH-PX和SOD活性增強。高血糖狀態(tài)下體內(nèi)自由基增多易造成氧化損傷，脂質(zhì)過氧化物可損傷腎臟基底膜和內(nèi)皮細胞。文獻報道，丹參素通過清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化從而延緩DN的進展[24]。實驗結(jié)果表明，匹伐他汀具有一定的抗炎、抗氧化作用。糖尿病引發(fā)的腎小球硬化是DN的主要病理特點[25]。本實驗中觀察腎臟的病理形態(tài)變化，可見普通飼料喂養(yǎng)的糖尿病大鼠腎臟出現(xiàn)腎小球水腫及炎癥細胞浸潤，而處于高脂環(huán)境下的大鼠可見腎血管硬化以及腎間質(zhì)的纖維化。匹伐他汀(2 mg·kg-1·d-1)干預3周可在一定程度上減輕腎臟局部炎癥病變及纖維化程度。

研究結(jié)果提示，匹伐他汀除了降脂作用外，對糖尿病大鼠的腎臟有一定的保護作用，國內(nèi)學者研究也得出類似的結(jié)論[26-28]?？紤]其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)一系列的細胞信號轉(zhuǎn)導通路從而抑制IL-6、TNF-α和VEGF等炎性因子的表達。同時匹伐他汀可抑制腎臟局部的氧化反應，通過抗炎、抗纖維化達到改善腎功能和緩解腎臟病變進一步發(fā)展的目的。此外，匹伐他汀未對血糖造成影響，可聯(lián)合用于糖尿病腎病的臨床治療。