陰部神經(jīng)電刺激對大鼠膀胱過度活動癥的治療作用

金梅 蔣秀嬋 陳涓涓 李香娟 徐智慧

膀胱過度活動癥（overactive bladder，OAB）是一種以尿急為特征的癥候群，發(fā)病率高，常伴有急迫性尿失禁、尿頻和夜尿增多等癥狀，嚴重影響患者生活質(zhì)量和身心健康[1-2]。OAB發(fā)病機制包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)等不同水平神經(jīng)控制及膀胱平滑肌本身的抑制失控和異常興奮，其治療目的在于達到接近生理的膀胱充盈和排尿狀態(tài)，改善下尿道功能，提高生活質(zhì)量[3]。OAB的治療方式包括行為治療、藥物治療和手術治療等。行為治療需長期堅持，療效緩慢?？鼓憠A能藥物治療會產(chǎn)生口干、便秘、眩暈、認知障礙等不良反應，常使患者中斷治療，病情反復惡化，加大治療難度[1,4]。因此尋找一種安全有效、不良反應小、治療滿意度高的治療方法一直是臨床研究的熱點。電刺激治療始于20世紀50年代，1984年Fall[5]經(jīng)陰部神經(jīng)電刺激治療尿失禁并取得一定的療效，陰部神經(jīng)電刺激治療是通過電刺激神經(jīng)來調(diào)控膀胱和尿道的功能[6]。目前關于陰部神經(jīng)電刺激對OAB治療是否有效的研究較少，前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）大鼠 OAB模型與人類 OAB的發(fā)病機制、排尿頻率和膀胱容量的減少程度[7]相似。本研究觀察陰部神經(jīng)電刺激在PGE2大鼠OAB模型中的治療作用，以驗證陰部神經(jīng)電刺激是否會增加模型大鼠的膀胱容量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠17只，體質(zhì)量235~360（274±27.06）g，采用烏拉坦（1.2g/kg）皮下注射麻醉。使用食管溫度探測器監(jiān)測體溫，并用再循環(huán)水毯使大鼠體溫保持在36~38℃。使用脈搏血氧計（燕牌2500A，美國NONIN公司）監(jiān)測心率和動脈血氧飽和度水平。

1.2 試劑與儀器 輸液泵（PHD 4400）購自美國Harvard Apparatus公司；壓力傳感器（ArgoTrans）購自美國Argon公司；雙極袖套電極（200μm）購自德國CorTec GmbH公司；模擬刺激隔離器（Model 2200）購自美國AM Systems公司；前置放大器（HIP5）購自美國Grass Products公司；PGE2（貨號 U108629-25G）購自英國Tocris Bioscience公司；氨基甲酸乙酯（貨號 U2500-500G）、烏拉坦（貨號 94300-50G）購自美國 Sigma-Aldrich公司。

1.3 藥物制備 稱取10mg PGE2于2.837ml無水乙醇中重新配制成10mmol/L儲備溶液，置于-20℃冰箱中儲存。取300μmol/L PGE2儲備溶液，用0.9%氯化鈉溶液稀釋100倍制備成100μmol/L PGE2溶液，此濃度在膀胱內(nèi)灌注時能有效降低膀胱容量[8]。300μl無水乙醇加入0.9%氯化鈉溶液配成30ml溶液，即空白基質(zhì)溶液。

1.4 實驗分組處理 通過腹部正中切口暴露膀胱，將PE-90聚乙烯導管（其末端被加熱以形成頸圈）通過膀胱頂端的小切口插入膀胱內(nèi)腔，并用6-0絲線在頸圈周圍縫合。將膀胱導管通過三通旋塞連接到輸液泵與Gould傳感器信號調(diào)節(jié)器連接的壓力傳感器上來測量膀胱內(nèi)壓。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為PGE2組11只和空白基質(zhì)溶液組6只，PGE2組向膀胱內(nèi)連續(xù)灌注100μmol/L PGE2溶液，空白基質(zhì)溶液組向膀胱內(nèi)連續(xù)灌注空白基質(zhì)溶液，記錄兩組大鼠灌注前后膀胱測壓（cystometrogram，CMG）參數(shù)。每次CMG結束后排空膀胱，停止灌注，使逼尿肌松弛5~10min后重復測壓，CMG數(shù)據(jù)至少重復記錄3次。之后PGE2組大鼠排空膀胱，陰部神經(jīng)電刺激膀胱，記錄CMG參數(shù)。

1.5 觀察指標

1.5.1 持續(xù)膀胱壓力測定 按1.4實驗方法測量膀胱內(nèi)壓，向所有大鼠膀胱連續(xù)灌注0.9%氯化鈉溶液，在膀胱出現(xiàn)自主排尿前停止膀胱灌注。當出現(xiàn)規(guī)律的排尿時，持續(xù)記錄1h。

1.5.2 膀胱容量測定 灌注開始到結束時注入膀胱內(nèi)液體的量即為膀胱容量。記錄兩組大鼠排尿體積和殘尿體積，排尿效率=排尿體積/膀胱容量×100%。最大收縮壓、收縮持續(xù)時間和膀胱收縮AUC于排尿收縮開始到排空結束的時間內(nèi)計算。

1.6 CMG和尿道外括約肌（EUS）肌電圖（EMG）參數(shù)測量方法 置好膀胱導管后，使用相同的腹側入路，使左側陰部神經(jīng)單側暴露，雙極袖套式電極包裹后連接模擬刺激器（圖1a）。雙極槳式電極（圖1b）放置于EUS的位置，并與前置放大器相連來進行同步EUS EMG測定。使用PowerLab/16SP采集單元對膀胱內(nèi)壓和EUS EMG信號進行放大、過濾和采樣，以1000或20000Hz采樣，并使用LabChart 7軟件進行離線分析。EUS EMG測量的時間是從膀胱充盈到膀胱收縮。

陰部神經(jīng)電刺激實驗中，選擇兩個不同頻率（1和10Hz）和振幅（0.8和1.0T）的雙相恒定脈沖電流（波寬為 0.1ms），其中T（即 Threshold）是引起 EUS EMG 反射活動的閾值（圖1c-d），是每個刺激脈沖誘發(fā)EMG的最小強度。

圖1 陰部神經(jīng)電刺激烏拉坦麻醉的大鼠產(chǎn)生EUS EMG（a：陰部神經(jīng)電刺激電極放置示意圖；b：記錄EUS EMG的定制雙極槳式電極；c：陰部神經(jīng)電刺激以1Hz誘發(fā)EUS EMG運動反應所需閾值的示例；d：陰部神經(jīng)電刺激以1Hz誘發(fā)EUS EMG運動反應所需閾值的0.8倍示例）

1.7 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；為了比較空白基質(zhì)和PGE2的作用，將兩組灌注空白基質(zhì)和PGE2后數(shù)據(jù)除以灌注前數(shù)據(jù)的比值進行l(wèi)og對數(shù)轉換，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PGE2對CMG參數(shù)和EUS EMG的作用 與灌注前相比，灌注后PGE2組大鼠膀胱容量降低，排尿效率增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；但灌注前后最大收縮壓、收縮持續(xù)時間、膀胱收縮AUC和EUS EMG比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖2和表1。

圖2 PGE2組大鼠灌注100μmol/L PGE2溶液前后膀胱壓力和EUS EMG參數(shù)圖[a：PGE2溶液灌注前膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）；b：從（a）的展開軌跡證實膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）在排尿期間存在高頻振蕩；c：PGE2溶液灌注后膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）；d：從（c）的展開軌跡顯示膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）在排尿期間存在高頻振蕩]

表1 PGE2組大鼠灌注PGE2溶液前后CMG參數(shù)和EUS EMG比較（n=11）

2.2 空白基質(zhì)對CMG參數(shù)和EUS EMG的作用 與灌注前相比，灌注后空白基質(zhì)溶液組大鼠最大收縮壓明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；但灌注前后膀胱容量、排尿效率、收縮持續(xù)時間、膀胱收縮AUC和 EUS EMG比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖3和表2。

2.3 PGE2和空白基質(zhì)對CMG參數(shù)和EUS EMG的作用比較 經(jīng)log對數(shù)轉換后，PGE2組膀胱容量明顯低于空白基質(zhì)溶液組，最大收縮壓明顯高于空白基質(zhì)溶液組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），證實PGE2對膀胱容量有影響。但兩組大鼠排尿效率、收縮持續(xù)時間、膀胱收縮AUC和EUS EMG比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞ 0.05），見表3。

2.4 陰部神經(jīng)電刺激對PGE2組大鼠CMG參數(shù)和EUS EMG的影響 引起盆腔EUS EMG反射的最小刺激振幅（圖1c-d）為29~256（107.0±76.3）μA，平均潛伏期（17.5±2.3）ms。PGE2組大鼠陰部神經(jīng)電刺激前后膀胱壓力和EUS EMG參數(shù)見圖4。與灌注PGE2相比，10Hz和1.0T的陰部神經(jīng)電刺激明顯使膀胱容量和EUS EMG肌電壓增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。陰部神經(jīng)電刺激對排尿效率、最大收縮壓力、收縮持續(xù)時間和膀胱收縮AUC均無明顯影響（均P＞0.05），見表4。

3 討論

圖3 空白基質(zhì)溶液組大鼠灌注空白基質(zhì)溶液前后膀胱壓力和EUS EMG參數(shù)圖[a：空白基質(zhì)溶液灌注前膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）；b：從（a）的展開軌跡顯示膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）在排尿期間存在高頻振蕩；c：空白基質(zhì)溶液灌注后膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）；d：從（c）的展開軌跡顯示膀胱壓力（上）和EUS EMG（下）在排尿期間存在高頻振蕩]

表2 空白基質(zhì)溶液組大鼠灌注空白基質(zhì)溶液前后CMG參數(shù)和 EUS EMG 比較（n=6）

表3 兩組大鼠CMG參數(shù)和EUS EMG比較

向膀胱灌注100μmol/L PGE2后，烏拉坦麻醉過的雌性大鼠膀胱容量減少。與灌注空白基質(zhì)相比，灌注PGE2后膀胱容量明顯減少，證實PGE2介導了膀胱容量的變化。雖然在烏拉坦麻醉下進行，這些結果與其他研究報道的PGE2膀胱灌注清醒大鼠和人類后的膀胱容量減少情況一致[8-9]。PGE2對排尿效率的影響尚未報道，但Aizawa等[7]和Ishizuka等[10]記錄了清醒大鼠的排尿量，間接地進行了排尿效率（排尿量/膀胱容量）比較，膀胱內(nèi)灌注10和50μmol/L PGE2前后的平均排尿效率分別為 96%和91%（n=20，Aizawa等），88%和 84%（n=12，Ishizuka等）。實驗中證實膀胱內(nèi)灌注PGE2后排尿效率增加，但其效果與空白基質(zhì)溶液組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明空白基質(zhì)與PGE2之間的相互作用可能導致了排尿效率的變化。這兩項研究進一步支持了本研究結果。本研究排尿效率與在大鼠清醒時間接計算的排尿效率相比較低，可能與烏拉坦麻醉可以降低排尿效率有關[11]。本研究觀察到灌注PGE2前后最大收縮壓、收縮持續(xù)時間、膀胱收縮AUC比較差異均無統(tǒng)計學意義，表明灌注PGE2后膀胱沒有像排尿一樣強烈地收縮。因此，筆者假設PGE2降低了尿道出口阻力，從而促進了排尿的增加。

以往研究中陰部神經(jīng)電刺激的效果很少集中在增強膀胱收縮，并且尚未研究用陰部神經(jīng)電刺激治療OAB。本研究表明通過適當?shù)年幉可窠?jīng)電刺激（10Hz、1.0T）后顯著增加了大鼠膀胱容量，但對排尿效率、最大收縮壓力、收縮持續(xù)時間和膀胱收縮AUC均無明顯影響。同樣觀察到EUS EMG在10Hz、1.0T的陰部神經(jīng)電刺激下顯著增加，但是誘發(fā)的EUS反射活動卻比1Hz、1.0T少。這種頻率依賴性下降與其他研究報道的陰部神經(jīng)電刺激期間EUS減弱一致[12-13]。研究結果表明，陰部神經(jīng)電刺激可能通過增加尿道出口阻力而不是通過EUS的直接反射活動。

表4 陰部神經(jīng)電刺激對PGE2組大鼠CMG參數(shù)和EUS EMG的影響（n=11）

盡管陰部神經(jīng)電刺激抵消了PGE2誘導的出口阻力，但這一機制本身并不能完全解釋受陰部神經(jīng)電刺激而增加的膀胱容量。疼痛理論[14]提供了陰部神經(jīng)電刺激如何緩解OAB的解釋，通過將該理論應用于下尿路，可推測陰部神經(jīng)電神經(jīng)刺激可抑制由PGE2誘發(fā)的C纖維活性的突觸傳遞，它調(diào)節(jié)了排尿閾值，導致膀胱容量在陰部神經(jīng)電刺激期間增加。

總之，膀胱內(nèi)灌注PGE2導致烏拉坦麻醉的雌性大鼠膀胱容量降低，排尿效率增加，但膀胱收縮幅度沒有變化。陰部神經(jīng)電刺激逆轉了PGE2誘導的膀胱容量變化，并在特定的刺激條件（10Hz、1.0T）下增加EUS EMG，故陰部神經(jīng)電刺激有望成為治療OAB的新型方法。