MALDI-TOF MS技術(shù)及其在食品微生物檢測方面的應(yīng)用

顧春華

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730000）

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種非常矚目的軟電離技術(shù)方法，該技術(shù)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革，其不但適用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的高通量篩選，還可以對(duì)寡核苷酸、基因的單核苷酸多態(tài)性、微生物鑒定分型等進(jìn)行分析，其優(yōu)點(diǎn)是：（1）軟電離，不會(huì)把分子打碎；（2）檢測范圍寬，最大可達(dá)400 kDa；（3）可以檢測混合物；（4）對(duì)鹽/污染物容忍性好[1]，因此，在蛋白質(zhì)組學(xué)[2]、基因研究[3]、臨床醫(yī)學(xué)[4-5]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。尤其對(duì)于臨床微生物的鑒定，MALDI-TOF MS技術(shù)可快速鑒定以前難以培養(yǎng)的厭氧菌（分枝桿菌（Mycobacterium）、真菌等）至種、亞種水平，操作簡單、速度快、成本低，且數(shù)據(jù)庫可不斷完善[6-7]。

目前，食品微生物的鑒定技術(shù)主要包括建立在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、生物化學(xué)水平上的經(jīng)典生理生化方法，以及逐步成熟的分子生物學(xué)方法。其中，經(jīng)典生化方法雖具有權(quán)威性，但操作繁瑣，檢測周期長。分子生物學(xué)方法雖然將鑒定水平提升至核酸分子，但僅能鑒定至屬，對(duì)種和亞種尚不能有效鑒定，而且要通過細(xì)菌脫氧核酸（deoxyri bonucleic acid，DNA）提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、序列測定與比對(duì)等復(fù)雜過程[8-9]。而MALDI-TOF MS技術(shù)雖然相比較上述方法有了質(zhì)的飛躍，發(fā)展勢頭也很迅猛，但在食品微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用上[7]，還是有一定的局限性，不如臨床微生物普及率大。本文將從食品微生物的培養(yǎng)條件、MALDITOF MS設(shè)備、數(shù)據(jù)庫、方法標(biāo)準(zhǔn)的局限性等方面對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行闡述。

1 MALDI-TOF MS技術(shù)原理和關(guān)鍵因素

MALDI-TOFMS技術(shù)是基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)與飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）的結(jié)合[10-11]?；|(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)于1987年由HILLENKAMP F及KARASM首次提出[12]。其原理是將待測物混入基質(zhì)中并被基質(zhì)包圍，通過激光轟擊待測樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，由于基質(zhì)濃度遠(yuǎn)高于待測物濃度，基質(zhì)分子吸收大部分激光能量，瞬間由固態(tài)轉(zhuǎn)變成氣態(tài)，形成基質(zhì)離子，在待測物與激發(fā)出的基質(zhì)離子的碰撞中，發(fā)生了待測物的離子化，在這個(gè)過程中，并不會(huì)導(dǎo)致高分子發(fā)生鏈斷裂，通常只生成分子離子及分子離子的多聚體[13]。飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）在20世紀(jì)40年代中期首先由STEPHENS W E提出[15]。其原理是在加速電壓和飛行距離一定的情況下，被電離的待測物質(zhì)的質(zhì)子數(shù)與電荷數(shù)的比值（m/z）與飛行時(shí)間的平方成正比。電離的生物分子在電場作用下加速通過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的時(shí)間及離子的數(shù)量，得到了橫軸為m/z、縱軸為峰強(qiáng)度值的圖譜，從而被質(zhì)量分析器檢測[15]。

在MALDI-TOF MS技術(shù)中，靶板上的基質(zhì)對(duì)最終的檢測結(jié)果起著重要作用，它的主要功能是吸收脈沖激光的能量，另外要使基質(zhì)能夠很好地分散樣品分子，防止其聚集，提高電離效率，并且還不能破壞待測分子。首先要求基質(zhì)對(duì)激光光源有很強(qiáng)的吸收，因此大多數(shù)基質(zhì)化合物均為含苯環(huán)的有機(jī)化合物；第二要求基質(zhì)與被測分子具有很好地相容性，同時(shí)不能有分子間的相互作用，所以得到一個(gè)合適的基質(zhì)并不容易[16-17]。目前，根據(jù)待測物和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，通常選用的基質(zhì)有2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）和芥子酸（sinapic acid，SA）等，在這些基質(zhì)中添加一些合適的添加物，形成共基質(zhì)在實(shí)踐中也是常見的。如將0.1%的甲酸加入基質(zhì)溶液，可以部分抑制來自培養(yǎng)基的鹽污染，提升實(shí)驗(yàn)效果。一般情況下，DHB用于寡糖、糖肽和糖蛋白的研究，它適用于小分子質(zhì)量組分，而CHCA一般用于蛋白質(zhì)的研究[18]。同一物種質(zhì)譜圖譜的不同，有時(shí)取決于所使用的基質(zhì)，而基質(zhì)的選擇則取決于對(duì)待測物的研究。

合成高分子的離子化在一般情況下是金屬離子陽離子化，很難通過加質(zhì)子使其離子化，往往需要加堿金屬鹽類或銀銅等金屬鹽類形成離子絡(luò)合物達(dá)到離子化目的。對(duì)于含胺官能團(tuán)的化合物（如蛋白質(zhì)、多肽），可與基質(zhì)提供的氫離子直接質(zhì)子化，不需直接加金屬離子[19]。

微生物有其自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，可以將由MALDITOF MS獲得的菌種圖譜與數(shù)據(jù)庫中的參考譜圖做對(duì)比，通過觀察特異峰的位置和強(qiáng)度，然后根據(jù)同源性距離得到最接近的菌種并給出相應(yīng)的鑒定分值。鑒定分值代表待測物與數(shù)據(jù)庫的參考菌株比對(duì)后的可信水平，最終可得到鑒定結(jié)果。而且MALDI的電離方式為軟電離，可使整個(gè)蛋白分子在離子化過程中都能夠保持完整，得出的質(zhì)譜圖會(huì)讓不同大小的分子有序排布，這樣就便于對(duì)譜圖進(jìn)行分析。通常，鑒定分值在1.99～2.30之間為滿足種鑒定，1.70～1.98之間為滿足屬鑒定、種可接受，分值在1.70以下為不可信，需要重新鑒定、查找原因或選用其他方法。菌種培養(yǎng)后的鑒定方法十分簡單，一種為取少量菌落直接點(diǎn)靶，加1μL基質(zhì)（CHCA溶于10%三氟乙酸與70%乙腈制成的過飽和溶液）充分混勻，干燥后上機(jī)；另一種將少量菌落溶解于蛋白提取液（10%三氟乙酸與70%乙腈等量混勻）10 μL中，充分研磨裂解，1 μL裂解液點(diǎn)靶，再加1 μL基質(zhì)，干燥后上機(jī)。

2 MALDI-TOF MS技術(shù)檢測的局限性

2.1 培養(yǎng)條件和樣品處理方式

MALDI-TOF MS技術(shù)目前仍依賴于培養(yǎng)，需要培養(yǎng)后的純菌株用于鑒定[20]。其鑒定依據(jù)包括（1）不同微生物的光譜指紋圖譜不同；（2）在光譜中，被檢測到的蛋白質(zhì)的峰（分子質(zhì)量）對(duì)某些屬、種，甚至亞種是特異的；（3）在相同的培養(yǎng)條件下所獲得的微生物譜圖是可重復(fù)的。有時(shí)，同種的微生物得到了不同的質(zhì)譜圖，是由于其生長條件的不同或不同的化學(xué)提取方法導(dǎo)致的。因此，選擇最合適的培養(yǎng)條件和控制標(biāo)準(zhǔn)化的樣品制備方法是獲得可重復(fù)質(zhì)譜圖的必要條件，在建立標(biāo)準(zhǔn)化方案時(shí)必須考慮，也就是基質(zhì)、培養(yǎng)基、溫度、濕度及培養(yǎng)時(shí)間的不同均會(huì)影響微生物蛋白的表達(dá)，使圖譜發(fā)生變化[21]。CONWAY G C等[22]研究了培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)時(shí)間均能影響菌種特異峰的出現(xiàn)，導(dǎo)致譜圖發(fā)生變化；HORNEFFER V等[23]在鑒定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)不同類型的培養(yǎng)基對(duì)蛋白圖譜有影響。但也有研究表明，雖然培養(yǎng)基、培養(yǎng)基溫度及培養(yǎng)時(shí)間的不同均會(huì)導(dǎo)致菌種蛋白質(zhì)圖譜發(fā)生變化，但對(duì)最終鑒定結(jié)果影響較小，鑒定結(jié)果仍然是可信的[24-26]。DIECKMANN R等[27]研究發(fā)現(xiàn)，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基得到的細(xì)菌蛋白圖譜，其特異峰基本一致；MADIGAN M T等[28]進(jìn)一步研究了生長在固體瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基的菌種產(chǎn)生蛋白圖譜差異的原因，發(fā)現(xiàn)可能是固體瓊脂上的菌落，中間的細(xì)胞相對(duì)于周邊的細(xì)胞年齡要大一些，而生長在肉湯中的培養(yǎng)物，它們的生長基本是同步的。因此，只要將實(shí)驗(yàn)條件控制好，技術(shù)的重現(xiàn)性還是不錯(cuò)的[29]。DIECKMANN R等[27]檢驗(yàn)了CHCA、DHB、SA三種不同基質(zhì)對(duì)沙門菌屬（Salmonella）的不同種及亞種的MALDI-TOF MS分析效果，結(jié)果表明，芥子酸（SA）對(duì)沙門菌屬的鑒定結(jié)果更好，SA更易與分析樣品混合均勻，使樣品靶上的各個(gè)位置解吸效果相似。另外，干燥后樣品靶點(diǎn)的厚度和稠度等因素都會(huì)對(duì)譜圖質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響。

2.2 檢測設(shè)備

MALDI-TOF MS技術(shù)發(fā)展至今雖然有很多的優(yōu)點(diǎn)，但還存在儀器本身的全譜靈敏度、分辨率和質(zhì)譜、光譜重現(xiàn)性不佳，靈敏度、可靠性較差等缺點(diǎn)[30]，因此人們普遍認(rèn)為MALDI-TOF MS不是定量的分析手段，在食品微生物檢測應(yīng)用中的進(jìn)一步推廣也受到影響。要從應(yīng)用角度解決MALDI-TOF MS定量分析，可以從樣品前處理、點(diǎn)樣方式和儀器本身的定量分析誤差等幾個(gè)方面著手。首先，樣本與基質(zhì)分子形式的結(jié)晶層在MALDI靶板上的分布是不均的，而且此類儀器采用的氮?dú)饧す馄鞯陌l(fā)射頻率通常被限制在50 Hz左右，所以通常在單位時(shí)間內(nèi)僅有一小部分（通常＜1%）樣品分子被激光照射電離和分析，使每個(gè)疊加后的質(zhì)譜圖中離子強(qiáng)度重現(xiàn)性非常不穩(wěn)定，誤差會(huì)高達(dá)30%以上。其次，MALDI-TOF MS設(shè)計(jì)中無法對(duì)不同大小離子在初始空間及速度上同時(shí)完成聚焦，加上通常MALDI-TOF激光照射入射角度的不對(duì)稱性，使得傳統(tǒng)MALDI-TOF MS儀器設(shè)計(jì)中有造成質(zhì)量偏倚性的許多因素，在不同質(zhì)量區(qū)間的分辨率、靈敏度有較大的區(qū)別。

2.3 數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)庫是MALDI-TOF MS的核心，待檢測微生物只有在數(shù)據(jù)庫里有相應(yīng)的質(zhì)譜圖才可能被鑒定。數(shù)據(jù)庫不僅要包含微生物所有的屬，也應(yīng)包括種甚至亞種，因此，有一個(gè)完善的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫意義重大。有兩個(gè)策略用于數(shù)據(jù)庫的建立，第一種策略是建立一個(gè)比較大的數(shù)據(jù)庫，包含每一個(gè)菌種的所有峰值信息，這就要求將每個(gè)菌種的所有參考菌株的信息全部納入其中，以便鑒定某菌株時(shí)可以產(chǎn)生良好的匹配。第二種策略是僅保留菌種的個(gè)別高強(qiáng)度特征峰值信息，這種方式對(duì)生長條件不同的菌株影響較小，匹配度較高[26]。有研究[31]關(guān)注不同的MALDI-TOF MS設(shè)備對(duì)匹配數(shù)據(jù)庫是否有影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)同一樣品不同設(shè)備產(chǎn)生的譜圖很接近，有60%的峰是重合的，大多數(shù)的差異僅僅是峰強(qiáng)度的差異。盡管因質(zhì)譜模式改變導(dǎo)致譜圖有所改變，但多數(shù)峰是保守峰，這些保守峰可以被用作鑒定微生物的潛在標(biāo)記物。而對(duì)于有些微生物未能被鑒定出來，或許因?yàn)樗切碌奈锓N或新分類，可以將新發(fā)現(xiàn)的物種添加到數(shù)據(jù)庫，按照物種分類不斷地去完善數(shù)據(jù)庫[32]。或者可以將一些不常見物種建立自己的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，但這對(duì)于一般的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室仍然很難實(shí)現(xiàn)。因此，建立一個(gè)強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫仍然是科學(xué)家致力去突破的一個(gè)方面，尤其對(duì)于食品微生物，還沒有專門的商業(yè)化數(shù)據(jù)庫開發(fā)出來。

2.4 方法標(biāo)準(zhǔn)

方法標(biāo)準(zhǔn)的建立和發(fā)布是檢驗(yàn)和技術(shù)交流的依據(jù)，也是食品安全監(jiān)督檢查和仲裁的依據(jù)。目前關(guān)于MALDI-TOF MS技術(shù)的微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)發(fā)布實(shí)施的只有GB/T 33682—2017《基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》和SN/T 3872—2014《出口食品中四種致病菌檢測方法MALDI-TOF-MS法》。第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是通則標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)性和可操作性均不強(qiáng)，第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)只涉及沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和霍亂弧菌（Vibrio cholerae），對(duì)于極其復(fù)雜、種類繁多的食品微生物來說顯然是不夠用的。建立一套完整的標(biāo)準(zhǔn)體系對(duì)于MALDI-TOFMS技術(shù)在食品微生物方面的應(yīng)用擴(kuò)展非常重要，它會(huì)加速將MALDI-TOF MS技術(shù)普及到各個(gè)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中，使之成為一種常規(guī)檢驗(yàn)。

3 討論和展望

近年來，MALDI-TOF MS已經(jīng)成功應(yīng)用于微生物的鑒定，顯示了其在細(xì)菌、酵母菌，真菌等鑒定方面的較強(qiáng)優(yōu)勢。SENG P等[33]在實(shí)驗(yàn)室對(duì)1 660個(gè)菌株進(jìn)行了鑒定，將單克隆直接點(diǎn)于靶板上，每個(gè)單克隆點(diǎn)4個(gè)靶點(diǎn)，如果有2個(gè)或以上靶點(diǎn)鑒定的值是可信的，則認(rèn)為這個(gè)鑒定是有效的。結(jié)果只有260個(gè)單克隆僅憑2個(gè)靶點(diǎn)閱讀未能得到鑒定，通過繼續(xù)閱讀剩余的2個(gè)靶點(diǎn)，則全部得到了鑒定。這項(xiàng)研究證實(shí)了MALDI-TOF MS技術(shù)的優(yōu)越性：具有95%以上的鑒定正確率，其中84%鑒定到種的水平，11%鑒定到屬，有2.8%未能鑒定出，有1.7%盡管鑒定分值很高，但鑒定結(jié)果是錯(cuò)誤的。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS技術(shù)與革蘭氏染色間沒有任何差異，可以將MALDI-TOF MS技術(shù)作為微生物鑒定的第一步，而無需先進(jìn)行革蘭氏染色。這些研究成果肯定了MALDI-TOF MS技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室的重要地位。VAN VEENV等[34]的實(shí)驗(yàn)方法與SENG P等[33]類似，只是對(duì)于鑒定不出來的每個(gè)菌株，增加了提取步驟，并且再次增加了2個(gè)靶點(diǎn)去進(jìn)行識(shí)別。結(jié)果得到了97%的正確鑒定（92%鑒定到種，5.1%鑒定到屬）。在這項(xiàng)工作中，有61株酵母菌（分布于7個(gè)屬和12個(gè)種）也得到了鑒定，其中85.2%正確鑒定到種，96.7%正確鑒定到屬。這表明該技術(shù)非常有效，非常適合高通量樣品檢測，同時(shí)研究者也強(qiáng)調(diào)了數(shù)據(jù)庫的不完整、某些物種的缺失和擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫的必要性。

MALDI-TOF MS技術(shù)提供了一種快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)和高通量的微生物鑒定方式。有報(bào)道將不經(jīng)過任何處理的經(jīng)過細(xì)菌污染的樣品，利用數(shù)據(jù)庫的蛋白圖譜可以鑒定存在的細(xì)菌[35]。這預(yù)示著MALDI-TOF MS的寬譜定量已經(jīng)有了初步的嘗試。縱然有這些優(yōu)點(diǎn)，但在重復(fù)性、定量方面，經(jīng)過眾多的改進(jìn)，仍然沒有統(tǒng)一的方案解決，商業(yè)化的數(shù)據(jù)庫也還需要不斷完善和強(qiáng)大。

我國在MALDI-TOF MS領(lǐng)域的發(fā)展也突飛猛進(jìn)，一批具有自主研發(fā)和生產(chǎn)能力的企業(yè)都推出了自己的產(chǎn)品，開發(fā)了諸多新型應(yīng)用，建立了一些特色數(shù)據(jù)庫，相信在不遠(yuǎn)的將來，隨著各種鑒定技術(shù)的聯(lián)合使用，或自身技術(shù)的突破，定能實(shí)現(xiàn)混合菌的檢測，或直接樣品的微生物檢測，而MALDI-TOF MS也有望成為首個(gè)由中國企業(yè)掌握全球領(lǐng)先技術(shù)和應(yīng)用的通用型質(zhì)譜儀。