循環(huán)腫瘤DNA中ESR1突變在激素受體陽性晚期乳腺癌內(nèi)分泌治療中的價值研究△

劉斌亮，馬飛#，陳閃閃，易宗畢，管秀雯，黎立喜，曾益新

1國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京100021

2中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院，北京100021

乳腺癌是全世界范圍內(nèi)最常見的女性惡性腫瘤，70%的患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性，內(nèi)分泌治療是該部分患者重要的治療方法之一[1-2]。雖然絕大多數(shù)ER陽性的患者可以從內(nèi)分泌治療中獲益，但是，患者在治療過程中會不可避免地產(chǎn)生內(nèi)分泌治療的耐藥[3]。編碼ERα的基因——雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）基因異常是導(dǎo)致內(nèi)分泌治療耐藥最常見的原因[4]。ESR1突變將引起ER活性的提高和ER表達的上調(diào)，甚至可以產(chǎn)生不依賴雌激素的自發(fā)活性[3,5]。對于采用多線內(nèi)分泌治療，尤其是既往使用芳香化酶抑制藥（aromatase inhibitor，AI）后發(fā)生疾病進展的患者，ESR1突變率明顯上升[5-6]。接受內(nèi)分泌治療后，15%～30%的乳腺癌患者會出現(xiàn)ESR1配體結(jié)合區(qū)域（ligand binding domain，LBD）的突變，其中，以D538G及Y537S位點突變最為常見。有研究證實，ESR1突變將縮短后續(xù)AI類藥物的無進展生存期（progression free survival，PFS），產(chǎn)生內(nèi)分泌治療耐藥[7]。氟維司群是一種新型ER拮抗劑，對于使用AI后出現(xiàn)耐藥或者進展的患者有效。多個研究證明，ESR1突變的患者對氟維司群相對敏感，氟維司群的療效優(yōu)于AI[5,8-9]。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）常攜帶腫瘤相關(guān)的單核苷酸變異、拷貝數(shù)改變及結(jié)構(gòu)變異等遺傳學改變，這一特點促使ctDNA成為潛在的生物標志物[10]。微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)可以檢測到≥0.001%的任何基因突變，是目前ctDNA中檢測ESR1突變的最常用方法[6,11]。雖然ESR1突變在內(nèi)分泌治療耐藥中的作用已得到廣泛的研究，但是ESR1的檢測在臨床中尚未得到足夠的重視。目前，尚無中國人群ESR1突變情況的報道，對于ESR1突變患者的后續(xù)治療尚無一致性結(jié)論。因此，本研究利用ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中ESR1的突變情況，旨在探索ESR1突變在乳腺癌內(nèi)分泌治療中的具體影響，為晚期乳腺癌的治療提供策略和參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年5月至2017年12月中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院收治的53例激素受體陽性的晚期乳腺癌患者作為研究對象。納入標準：①女性，年齡≥18歲；②均經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌；③穿刺或手術(shù)切除標本免疫組織化學染色結(jié)果為激素受體陽性；④有可測量病灶；⑤臨床分期均為Ⅳ期；⑥主要器官功能正常。排除標準：①懷孕期、哺乳期婦女；②合并外周神經(jīng)系統(tǒng)障礙或有明顯精神障礙及中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙史；③合并嚴重的心血管疾病、肝病（如肝硬化等）、呼吸系統(tǒng)疾病、腎臟疾病或不能控制的糖尿病或高脂血癥。53例患者的年齡為31～79歲，平均年齡為（52.7±11.4）歲；原發(fā)灶位置：左側(cè)29例，右側(cè)24例；手術(shù)方式：保乳手術(shù)8例，根治性切除術(shù)32例，術(shù)式不詳3例，無法手術(shù)10例（初治晚期患者）。53例患者中，10例患者為初治Ⅳ期患者，診斷時即已發(fā)生轉(zhuǎn)移，其余43例患者為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者。入組患者中，除了2例患者未行術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療以及1例患者于術(shù)后放療中即出現(xiàn)復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)入晚期治療外，其余患者均給予標準的輔助放化療和內(nèi)分泌治療?；颊呒凹覍倬鶎Ρ狙芯恐椴⒑炇鹬橥鈺?，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 ddPCR檢測ctDNA中的ESR1突變

1.2.1 樣本采集 于內(nèi)分泌治療前抽取患者的肘正中靜脈血10 ml于EDTA抗凝管中，采集2 h內(nèi)需進行離心處理。全血標本在4℃的溫度下離心10 min，離心速度為4143 r/min，離心半徑為12 cm。離心后分離上層血漿，并在4℃的溫度下離心10 min，離心速度為12 023 r/min，離心半徑為12 cm。去除殘余的細胞及細胞碎片；血漿和相應(yīng)的血細胞標本置于-80℃的冰箱中保存待測。嚴格按照Mag-MAX?Cell-Free DNA Isolation Ki（t購自美國Applied Biosystems公司）說明書步驟提取血清游離DNA，提取的游離DNA樣本保存于-20℃冰箱中。

1.2.2 特異性引物探針設(shè)計 根據(jù)人ESR1基因序列，采用Beacon DesignerTM8.12軟件設(shè)計檢測ESR1基因Y537S和D538G位點的序列特異性寡核苷酸引物和探針[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。（表1、表2）

表1 人ESR1基因Y537S位點ddPCR特異性寡核苷酸引物探針

表2 人ESR1基因D538G位點ddPCR特異性寡核苷酸引物探針

1.2.3 數(shù)字PCR檢測游離DNA中的ESR1突變QuantStudio?3D數(shù)字PCR系統(tǒng)采用高密度納升微流控芯片，結(jié)合特異性引物和Taqman探針技術(shù)，以FAM（藍色熒光）和VIC（綠色熒光）分別標記識別突變型DNA和非突變型DNA的探針，將樣本分到20 000個單獨反應(yīng)孔中，單獨進行PCR擴增，從而實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”；擴增結(jié)束后，通過對呈現(xiàn)兩種信號類型的反應(yīng)孔比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)，從而實現(xiàn)對樣本突變的分析。ESR1突變豐度≥0.01%定義為ESR1突變。按照QuantStudio?3D數(shù)字PCR系統(tǒng)標準流程進行操作。反應(yīng)體系：7.5 μl QuantStudio? 3D digital PCR Master Mix v2；1.2 μl 10 μmol/L上游和下游引物；0.3 μl 10 μmol/L野生型和突變型探針；20 ng模板（ctDNA樣本）；去離子水補足15 μl終體積。反應(yīng)條件：96℃10 min 1個循環(huán)；57℃2 min，98 ℃ 30 s，共39個循環(huán)；57℃ 2 min，1個循環(huán)，最終將溫度降至10℃進行保存。

1.3 ESR1突變與內(nèi)分泌治療效果的關(guān)系

為了評估ctDNA檢測ESR1對療效評價的時效性，同時記錄患者影像學或腫瘤標志物水平以評估腫瘤進展的時間，兩者之差即為ctDNA提前發(fā)現(xiàn)腫瘤進展的時間。

根據(jù)實體瘤療效評價標準1.1版[12]，每2～3個月對患者的臨床療效評估1次。原發(fā)性內(nèi)分泌治療耐藥指的是患者術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，或轉(zhuǎn)移性乳腺癌經(jīng)內(nèi)分泌治療6個月內(nèi)出現(xiàn)疾病進展。繼發(fā)性內(nèi)分泌治療耐藥指的是術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療2年后出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，或于完成輔助內(nèi)分泌治療后12個月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，或轉(zhuǎn)移性乳腺癌經(jīng)內(nèi)分泌治療超過6個月出現(xiàn)疾病進展[11]。PFS指從治療開始至疾病進展或死亡的時間。未達到疾病進展或死亡的患者，計算其末次隨訪時間。在本研究中，若ESR1檢測時患者處于內(nèi)分泌治療中，則記錄該內(nèi)分泌治療的PFS；若檢測時患者處于化療中，則選取檢測時間后1年內(nèi)最近的一次內(nèi)分泌治療的PFS。為了探索應(yīng)用氟維司群的最佳時機，本研究根據(jù)內(nèi)分泌治療所處的線數(shù)將入組患者進行分組。因納入的一線內(nèi)分泌治療的例數(shù)較少，因此，將患者分為一、二線組（n=11）和≥三線組（n=10）。

1.4 隨訪

所有患者的隨訪截止日期為2018年5月20日，隨訪時間為0.53～28.97個月，中位隨訪時間為5.03個月。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。建立COX比例風險回歸模型進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ESR1檢測結(jié)果與患者基線資料

53例患者中，ESR1突變患者為21例，ESR1非突變患者32例。21例ESR1突變患者中，6例患者D538G 突變，突變率為28.6%（6/21）；13例患者Y537S突變，突變率為 61.9%（13/21）；2例患者D538G和Y537S雙位點突變，突變率為9.5%（2/21）。根據(jù)ESR1的突變情況將患者分為ESR1突變組和ESR1非突變組。ESR1突變組最常見的轉(zhuǎn)移部位是骨和肝，且ESR1突變組的肝轉(zhuǎn)移率為66.7%（14/21），高于ESR1非突變組的34.4%（11/32），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.306，P=0.021）。兩組患者的病理類型、Luminal分型、月經(jīng)情況、腫瘤家族史等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 ESR1突變和ESR1非突變患者的基線資料比較

在21例ESR1突變患者中，7例患者及時更改治療方案，且均將化療作為下一步的治療計劃；12例患者繼續(xù)采用原方案進行治療；1例患者因身體狀態(tài)極差無法繼續(xù)接受治療；1例患者死亡。

2.2 ESR1突變與內(nèi)分泌治療的關(guān)系

ESR1非突變組的平均內(nèi)分泌治療線數(shù)為（1.50±1.14）線，明顯少于ESR1突變組的（2.62±1.20）線，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.427，P＜0.01）。既往使用過AI患者的ESR1突變率為42.9%（18/42），既往未使用過AI的患者的ESR1突變率為27.3%（3/11），兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 ESR1突變與內(nèi)分泌治療效果的關(guān)系

2.3.1 ctDNA檢測ESR1對療效評價的時效性本研究發(fā)現(xiàn)，相較于傳統(tǒng)的影像學或者腫瘤標志物評估方法，ctDNA可平均提前70.1天發(fā)現(xiàn)疾病進展。

2.3.2ESR1突變與PFS的關(guān)系 本研究的隨訪率為100%，49例患者到達研究終點。ESR1非突變組的中位 PFS 為5.8個月（95%CI：2.9～8.7），ESR1突變組患者的中位PFS為4.6個月（95%CI：3.7～5.5），兩組患者的中位PFS比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.194，P＞0.05）。（圖1）

圖1 ESR1突變組（n=32）與ESR1非突變組（n=21）的無進展生存曲線

2.3.3 氟維司群治療對ESR1突變者PFS的影響在ESR1突變的患者中，氟維司群治療者13例，非氟維司群治療者8例（托瑞米芬4例，來曲唑1例，依西美坦3例）。氟維司群治療組患者的中位PFS為5.2個月（95%CI：3.9～6.4），HR=0.37（0.14～0.97），長于非氟維司群治療組患者的2.9個月（95%CI：0.6～5.3），HR=0.37（0.14～0.97），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.556，P＜0.05）（圖2）。一、二線治療組中，氟維司群治療患者的中位PFS為5.0個月，雖長于非氟維司群治療的2.9個月，HR=0.40（0.10～1.62），但差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.857，P＞0.05）。≥三線治療組中，氟維司群治療患者的中位PFS為5.2個月，長于非氟維司群治療患者的2.1個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.116，P＜0.05）。

3 討論

本研究是目前已知的中國人群中最大規(guī)模的檢測ctDNA中ESR1突變的臨床研究。本研究發(fā)現(xiàn)激素受體陽性晚期乳腺癌的ESR1突變率為39.6%，與FERGI和SoFEA研究結(jié)果的37.3%和39.1%基本一致[8,13]，但明顯高于Toy等[14]的結(jié)果，可能原因與本研究納入患者多為經(jīng)治多次有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)ESR1突變中Y537S突變比例高達61.9%，遠超既往文獻報道[14-15]。主要原因考慮為本研究例數(shù)較少，但因為目前并無中國人群ESR1突變情況的統(tǒng)計，種群差異并不能完全除外。

圖2 氟維司群治療組（n=13）和非氟維司群治療組（n=8）的無進展生存曲線

與既往文獻報道相似，本研究發(fā)現(xiàn)ESR1突變多見于多線內(nèi)分泌治療的患者中。機制可能是內(nèi)分泌治療壓力下ESR1突變作為具有生存優(yōu)勢的基因被選擇，逐漸成為腫瘤中占主導(dǎo)地位的細胞株[16]。除此以外，本研究發(fā)現(xiàn)ESR1突變?nèi)巳旱母无D(zhuǎn)移率高于非ESR1突變?nèi)巳?，提示對明確已知ESR1突變的患者或多線內(nèi)分泌治療之后的晚期患者及時、定期、規(guī)范地使用肝臟超聲、腹部增強CT或MR評估復(fù)查肝臟是十分必要的。

ESR1突變將產(chǎn)生AI類藥物的完全耐藥和他莫昔芬、氟維司群的部分耐藥[6]。SOFEA臨床試驗證明了ESR1突變患者中使用氟維司群比依西美坦有更長的PDF[8]。本研究也證實了ESR1突變者有較短的PFS，且氟維司群相較于AI類藥物可以帶來更多的治療獲益。在不同內(nèi)分泌治療線數(shù)的亞組分析中，發(fā)現(xiàn)氟維司群在后線內(nèi)分泌治療中優(yōu)勢更加明顯。其可能原因是后線內(nèi)分泌治療群體中內(nèi)分泌治療的耐藥性升高，因而更能體現(xiàn)氟維司群克服ESR1突變耐藥的優(yōu)勢。

ESR1突變在臨床中的應(yīng)用仍然是疑惑重重。在本研究中，僅有1/3的ESR1突變患者根據(jù)基因檢測報告及時更換當前的治療方案。此外，雖然發(fā)現(xiàn)ctDNA可以比影像學或者腫瘤標志物平均提前70.1天發(fā)現(xiàn)腫瘤進展，但鑒于患者定期復(fù)查時間和腫瘤進展間固有的時間差，其真正領(lǐng)先時間及可靠性尚無法明確。因此，是否應(yīng)該根據(jù)ESR1突變結(jié)果立即調(diào)整治療方案以及如何選擇最佳的后續(xù)治療方案都是亟需解決的問題。

即使氟維司群在內(nèi)分泌治療中的地位逐步上升，但該研究發(fā)現(xiàn)其在ESR1突變?nèi)后w的各線中位PFS時間僅3～5個月，耐藥后的進一步治療沒有統(tǒng)一的標準。隨著苯卓昔芬、RAD1901、GDC0810等新型雌激素受體拮抗劑在體內(nèi)外實驗中表現(xiàn)出較好的療效[14,17]，今后將會有更多手段治療內(nèi)分泌治療耐藥的患者。

ctDNA無創(chuàng)、方便等優(yōu)勢為ESR1突變的動態(tài)監(jiān)測提供了可靠的平臺。ESR1突變的監(jiān)測應(yīng)當從明確診斷乳腺癌開始，貫穿整個內(nèi)分泌治療過程，從而進一步揭示ESR1突變產(chǎn)生的時機及與預(yù)后的關(guān)系，優(yōu)化臨床決策。盡早發(fā)現(xiàn)ESR1突變以便及時采取更優(yōu)的治療方案。其實除了ESR1外，涉及內(nèi)分泌治療耐藥的基因還包括分子磷脂酰肌醇-3-激酶、TP53、人表皮生長因子受體2、表皮生長因子受體等多種基因[18]。因此 Sefrioui等[19]、Gu 和Fuqua[20]提出了一個較為合理的監(jiān)測體系和方法：在乳腺癌患者接受治療前，使用NGS測序技術(shù)得出乳腺癌基線時的相關(guān)的突變，了解如ESR1，PI3K，TP53，HER-2，EGFR等基因突變的全貌以全面評估腫瘤的情況。針對性的治療后再定期用ddPCR去確認原先存在的突變，并比較治療前后的突變頻率是一種合理的方法。