去白細(xì)胞冷自體血停搏液減輕嬰兒體外循環(huán)心臟手術(shù)心肌損傷作用的研究

王元祥，周曉東，孟保英，劉懷普，張 程，丁以群

先天性心臟病是引起嬰幼兒死亡的主要疾病之一，發(fā)病率約8‰～10‰。在體外循環(huán)心臟直視手術(shù)中，由于心肌缺血缺氧、心肌缺血再灌注、各種酶、炎性介質(zhì)、自由基大量釋放等因素，均可導(dǎo)致不同程度的心肌損傷［1］。心臟既是主要促炎性因子的生產(chǎn)源頭又是炎癥損傷的靶器官，而激活的白細(xì)胞在心肌炎癥損傷的過程中又扮演著重要角色。因此，臨床上采用多種方式控制體外循環(huán)中白細(xì)胞的激活，濾除含血停搏液內(nèi)的白細(xì)胞即為其中較為常用的方法之一［2］。本院在應(yīng)用冷自體血停搏液保護(hù)嬰兒心肌的研究基礎(chǔ)上，通過去除自體血停搏液中白細(xì)胞（通過過濾法），以期減輕體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)心肌損傷，利于嬰兒心肌保護(hù)。

1 對象與方法

1．1 研究對象 2015年1月1日至2016年6月30日在本院接受治療的室間隔缺損嬰兒共100例（可合并房間隔缺損、動脈導(dǎo)管未閉、肺動脈瓣狹窄及卵圓孔未閉等簡單畸形），年齡≤10月；體質(zhì)量≤8 kg；經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過（深兒醫(yī)倫審（科研）2018019），并經(jīng)監(jiān)護(hù)人知情并同意，采用臨床對照研究，將納入研究的患兒分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組50例。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并復(fù)雜心血管畸形，如主動脈弓縮窄、肺靜脈異位引流、肺動脈閉鎖、大動脈轉(zhuǎn)位等，排除深低溫停循環(huán)病例，具有肝腎功能異常、肺炎等合并癥。

1．2 研究方法 手術(shù)由同一組醫(yī)生、麻醉師、體外循環(huán)師合作完成。研究對象均采用氣管插管靜脈及吸入麻醉藥物全麻，采用正中開胸體外循環(huán)輔助心內(nèi)直視手術(shù)。體外循環(huán)采用Stockert V型人工心肺機(jī)，采用整合內(nèi)置動脈微栓濾器的集成式膜式氧合器，主動脈端管道安裝氣泡報(bào)警裝置。根據(jù)術(shù)前紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）采用無血預(yù)充或成份血預(yù)充，體外循環(huán)采用淺、中低溫（25～32℃ ），HCT 0．25～0．30。 并行循環(huán)降溫，改良超濾。

心臟停搏液制備及灌注：所有患兒于體外循環(huán)建立后經(jīng)主動脈根部按血液 ∶晶體4∶1比例快速抽取血液（晶體配方為0．9%氯化鈉105 ml，5%葡萄糖 105 ml，10%氯化鉀 15．5 ml，5%碳酸氫鈉 15 ml，25%硫酸鎂 2．5 ml），K＋濃度20 mmol／L，抽血時間約30～50 s，保持動脈收縮壓≥40 mm Hg，自體血抽取完畢后即開始體外循環(huán)，通過血?dú)夥治鰴z測并維持合理的HCT，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用一次性使用去白細(xì)胞塑料血袋（山東威高）濾除白細(xì)胞（過濾速度50 ml／min），制成去白細(xì)胞冷自體血停搏液，對照組采用冷自體血停搏液。并將配制的心臟停搏液浸入冰屑液中制成4℃ 冷停搏液備用。主動脈阻斷后經(jīng)主動脈根部采用心肌停搏液灌注系統(tǒng)（東莞科威）及嬰兒型灌注針（天津塑料品研究所）灌注心臟停搏液，灌注劑量為 30 ml／kg。

1．3 標(biāo)本采集及檢測 分別在體外循環(huán)前及主動脈開放后 30 min，1 h，6 h，12 h，24 h 檢測血清人類心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（human heart fatty acid binding protein，HH－FABP）、肌鈣蛋白 I（cardiac troponin I，cTnI）及磷酸肌酸激酶同工酶（creatine kinase－MB，CKMB）的含量。取靜脈血5 ml，離心后取血清標(biāo)本置于EP管中，并保存在－20℃冰箱中待測。采用ELISA法檢測血清HH－FABP濃度，采用全自動生化分析儀檢測血清cTnI、CKMB含量。根據(jù)2010年美國超聲心動圖協(xié)會指南，應(yīng)用雙平面Simpson法測量術(shù)前及標(biāo)本采集時間點(diǎn)的左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16．0建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)、X2檢驗(yàn)的方法比較兩組患兒基本情況，采用重復(fù)測量方差分析比較兩組及不同時間點(diǎn)HHFABP、cTnI、CKMB 的含量及 LVEF。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 基本信息 共納入病例 100 例，年齡（3．99±0．69）月，體重（5．29±0．24）kg。 實(shí)驗(yàn)組共 50 例，其中男26例（52%），女24例（48%）；對照組50例，其中男28例（56%），女22例（44%）。兩組患兒基本情況分布見表1。

2．2 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清 HH－FABP含量比較 經(jīng)重復(fù)測量方差分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組HH－FABP含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝266．666，P＜0．001），不同時間點(diǎn) HH－FABP 含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝788．279，P＜0．001），且時間與組別間存在交互作用（F＝35．752，P＜0．001）。 進(jìn)一步對各時間點(diǎn)時實(shí)驗(yàn)組與對照組的HH－FABP含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，術(shù)前兩組患兒血清HH－FABP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，開放后30 min，60 min，12 h三個時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組的HH－FABP含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，開放后24 h實(shí)驗(yàn)組與對照組HHFABP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2．3 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清cTnI含量比較 經(jīng)重復(fù)測量方差分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組血清cTnI含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝21．478，P＜0．001），不同時間點(diǎn)血清cTnI含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝675．898，P＜0．001），且時間與組別間存在交互作用（F＝7．580，P＜0．001）。 進(jìn)一步對各時間點(diǎn)時實(shí)驗(yàn)組與對照組的血清cTnI含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，術(shù)前、開放后30 min、60 min、12 h四個時間點(diǎn)兩組患兒血清cTnI含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，開放后24 h時實(shí)驗(yàn)組與對照組血清cTnI含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2．4 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清CKMB含量比較經(jīng)重復(fù)測量方差分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組血清CKMB含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝23．327，P＜0．001），不同時間點(diǎn)血清CKMB含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝260．150，P＜0．001），且時間與組別間無交互作用（F＝3．452，P＝0．09）。 進(jìn)一步對各時間點(diǎn)時實(shí)驗(yàn)組與對照組的血清CKMB含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，術(shù)前、開放后60 min、24 h三個時間點(diǎn)兩組患兒血清CKMB含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，開放后30 min及開放后12 h兩個時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組血清CKMB含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表1 兩組患兒基本情況（n＝50）

表2 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清HH－FABP含量比較（μg／L，n＝50，±s）

表2 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清HH－FABP含量比較（μg／L，n＝50，±s）

項(xiàng)目 實(shí)驗(yàn)組 對照組 P值術(shù)前 4．02±1．98 4．31±1．66 0．406開放后 30 min 45．65±9．39 68．21±14．89 ＜0．001開放后 60 min 51．96±9．87 80．18±15．72 ＜0．001開放后 12 h 25．39±7．38 37．58±10．14 ＜0．001開放后 24 h 6．05±2．65 7．45±2．46 0．532

表3 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清cTnI含量比較（μg／L，n＝50，±s）

表3 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清cTnI含量比較（μg／L，n＝50，±s）

項(xiàng)目 實(shí)驗(yàn)組 對照組 P值術(shù)前 1．29±0．11 1．27±0．29 0．224開放后 30 min 1．82±0．42 2．06±0．98 0．526開放后 60 min 1．96±0．57 2．16±0．50 0．435開放后 12 h 10．47±3．86 11．81±3．04 0．110開放后 24 h 15．70±6．17 19．83±6．07 ＜0．001

2．4 兩組患兒不同時間點(diǎn)LVEF值比較 經(jīng)重復(fù)測量方差分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組LVEF值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6．561，P＝0．014），不同時間點(diǎn) LVEF值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝20．216，P＜0．001），時間與組別間無交互作用（F＝1．267，P＝0．284）。 進(jìn)一步對各時間點(diǎn)時實(shí)驗(yàn)組與對照組的LVEF值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，術(shù)前、開放后30 min、24 h三個時間點(diǎn)兩組患兒LVEF值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，開放后60 min及開放后12 h兩個時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組LVEF值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表4 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清CKMB含量比較（U／L，n＝50，±s）

表4 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清CKMB含量比較（U／L，n＝50，±s）

項(xiàng)目 實(shí)驗(yàn)組 對照組 P值術(shù)前 5．74±4．36 5．87±3．19 0．842開放后 30 min 37．15±10．17 62．26±14．47 ＜0．001開放后 60 min 52．54±14．36 57．35±11．91 0．397開放后 12 h 112．21±36．12 127．20±36．19 0．038開放后 24 h 72．95±43．41 84．76±39．74 0．055

表5 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清LVEF值比較（%，n＝50，±s）

表5 兩組患兒不同時間點(diǎn)血清LVEF值比較（%，n＝50，±s）

項(xiàng)目 實(shí)驗(yàn)組 對照組 P值術(shù)前 54．04±10．59 56．35±13．59 0．399開放后 30 min 50．15±12．99 51．29±11．09 0．579開放后 60 min 54．27±9．73 59．91±10．54 0．004開放后 12 h 58．24±11．52 63．77±12．32 0．038開放后 24 h 62．89±9．29 63．14±10．76 0．908

3 討 論

隨著外科及體外循環(huán)技術(shù)的發(fā)展，先天性心臟病患兒趨于復(fù)雜化，心肌保護(hù)顯得尤為重要。小兒先天性心臟病手術(shù)中，由于心肌未發(fā)育成熟，心肌的結(jié)構(gòu)、代謝和功能與成人存在較大差異，小兒尤其是嬰幼兒術(shù)中心肌損傷有其自身的特點(diǎn)，這對圍手術(shù)期的及時處理提出了更高的要求。經(jīng)過多年的心肌保護(hù)策略的發(fā)展，多項(xiàng)研究表明含血停搏液的心肌保護(hù)作用要優(yōu)于傳統(tǒng)晶體停搏液［3－5］，在國外已被廣泛應(yīng)用［6］，它能為心肌提供有氧環(huán)境，延長對缺血的耐受時限。各離子濃度更接近生理情況，減少電解質(zhì)紊亂，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［6］，但仍不能解決血液中的炎性因子及白細(xì)胞對小兒心肌的損害。白細(xì)胞是氧化應(yīng)激作用中起主要作用的環(huán)節(jié)，活化的中性粒細(xì)胞不僅能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和結(jié)締組織，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)更為強(qiáng)烈，還可通過呼吸爆發(fā)而產(chǎn)生更多的氧自由基，進(jìn)一步對心肌細(xì)胞產(chǎn)生損害，更多的白細(xì)胞堵塞心肌微小血管，造成“無復(fù)流”現(xiàn)象［7］。因此，雖然含血停搏液被證實(shí)對小兒心肌有更好的保護(hù)作用，但血液中活化的白細(xì)胞對未成熟心肌的損傷仍不能忽視。

心肌細(xì)胞在受到損傷后可釋放生化標(biāo)志物，在血清及組織中檢測其濃度及活性是檢測心肌損傷、損傷程度和恢復(fù)狀況的重要手段。CKMB、cTnI在臨床上被廣泛用于急性心肌缺血的早期診斷，一直作為判斷心肌損傷的主要指標(biāo)，但有其局限性，主要表現(xiàn)為其在心肌特異性較低，在血清中的濃度達(dá)到高峰的時間較晚，其濃度下降曲線較平緩，不能進(jìn)行心肌損傷的早期和二次判斷。HH－FABP作為一種新的心肌損傷的標(biāo)志蛋白，日益受到重視和關(guān)注［8］。心肌損傷早期，在缺氧期間，HH－FABP被大幅度表達(dá)以促進(jìn)脂肪酸氧化供能，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)的HHFABP濃度短時間內(nèi)大幅升高。本研究結(jié)果顯示，患者HH－FABP在主動脈開放后1 h達(dá)高峰，而CKMB和cTnI峰值出現(xiàn)在術(shù)后12 h及24 h，提示 HHFABP可作為心外科圍手術(shù)期心肌缺血和損傷的早期診斷指標(biāo)，與既往研究結(jié)果一致［9－10］。

國外有研究表明去白細(xì)胞心臟停搏液對小兒心肌有保護(hù)作用［11］。本研究實(shí)驗(yàn)組采用去白細(xì)胞冷自體血停搏液，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后各時間點(diǎn)HH－FABP、cTnI及CKMB與對照組相比均明顯降低，表明去白細(xì)胞冷自體血停搏液對嬰兒心肌的保護(hù)作用要優(yōu)于單純含血停搏液。這可能因?yàn)樾募≡谌毖陂g，停搏液中的白細(xì)胞可能會浸入心肌，釋放炎性因子，堵塞微小血管，并激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成不同程度的心肌損傷，許多心臟中心嘗試在體外循環(huán)中利用白細(xì)胞濾器去除白細(xì)胞，以減輕缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)。去除停搏液中的白細(xì)胞能使得心肌在缺血停搏期間，免于白細(xì)胞浸潤，避免了因白細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，更好的保護(hù)心肌細(xì)胞。另外，本研究顯示，實(shí)驗(yàn)組機(jī)械通氣時間低于對照組，術(shù)后1 h和12 h的LVEF優(yōu)于對照組，表明去除停搏液中的白細(xì)胞在一定程度上能更好地促進(jìn)患兒術(shù)后心肺功能的恢復(fù)，但在住院時間和ICU滯留時間上并沒有顯著性差異，因此去白細(xì)胞冷自體血停搏液能否改善患兒的臨床預(yù)后，仍有待進(jìn)一步研究。