荷青花全草有機(jī)成分的分離與鑒定

馮磊，李飛，于夢娟，魏恩巍，吳思桐，曲明慧，王一孝，王廣樹

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021）

荷青花〔Hylomecon japonica（Thunb.） Prantl et Kundig（Papaveraceae）〕為罌粟科荷青花屬植物，多年生早春類短命植物，分布于我國東北至華中、華東地區(qū)[1]。荷青花全草具有祛風(fēng)除濕、舒筋活血、消腫止痛等功效[2]。目前文獻(xiàn)中有關(guān)荷青花全草的化學(xué)成分僅為生物堿類、酚類、皂苷類等化合物[3-5]。關(guān)于荷青花全草化學(xué)成分的研究較少，本研究對荷青花全草植物中10%乙醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分的分離及鑒定，為進(jìn)一步探究荷青花植物的開發(fā)利用及其有效成分藥理活性篩選奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)材料

荷青花全草于2015 年6～8 月采自吉林省雙陽市，經(jīng)洗滌、干燥后保存于實(shí)驗(yàn)室，備用，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張靜敏教授鑒定為荷青花〔H．japonica（Thunb.）Prantl et Kundig（Papaveraceae）〕。

1.2 儀器與試劑

Varian UNITYINOVA2400 核磁共振儀（BRUKER公司）；LDI1700-TOF-MS激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（惠普公司）；LC-10AT高效液相色譜儀（島津公司）；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器有限責(zé)任公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9030A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏公司）；KQ-250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；D-101 吸附型大孔樹脂（天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司）；薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（青島恒澤硅膠制品有限公司）；所用試劑均為分析純（北京化工集團(tuán)有限公司）。

2 提取與分離

2.1 浸提

干燥的荷青花全草，經(jīng)70%乙醇浸提，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后得到提取物浸膏，備用。

2.2 洗脫

將濃縮得到的提取物浸膏上樣于預(yù)處理過的D101 大孔吸附樹脂柱并進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑條件為乙醇（0%、10%、30%、50%、70%、95%），薄層色譜監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，10%乙醇洗脫效果較好，故收集得到10%乙醇洗脫物。

2.3 分離

將10%乙醇洗脫物反復(fù)進(jìn)行硅膠柱色譜分離，展開劑條件為氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水（1.5∶1.8∶4.0∶1.0），分離 4 次得到A、B、C、D 4 個組分，將 4 個組分經(jīng)薄層色譜與硅膠柱色譜多次分離。薄層色譜展開劑條件為氯 仿∶ 甲 醇∶ 乙 酸 乙 酯∶ 水∶ 甲 酸（1.5∶3.5∶4.0∶0.5∶0.5），硅膠柱色譜展開劑條件為氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水（1.5∶2.5∶4.0∶1.0），最終得 A1、B1、C2、C4、D1 和 D2 6 個組分。

2.4 純化

將分離得到的6 個組分經(jīng)高效液相色譜純化，色譜條件為色譜柱：Gemini 5m C1（8250 10 mm）；檢測波長：254 nm；流速：3.0 mL/min；進(jìn)樣量：50L；柱溫：25 ℃；流動相：乙腈（A）與0.1%甲酸（B）。洗脫條件（A1、B1：0～9.00 min CB 97%，9.01～30.00 min CB 97%～90%；C2：0～30.00 min CB 85%～70%；C4：0～13.00min CB 76%；D1、D2：0～10.00min CB72%），分別得到化合物1～7。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 化合物1

室溫下為白色粉末，易溶于甲醇，10%硫酸-乙醇加熱顯色為黃色，Molish 反應(yīng)陽性，說明該結(jié)構(gòu)連有糖基。HR TOF-MS m/z：[M+Na]+443.1144，結(jié)合13CNMR、1H-NMR 得出分子式為 C17H24O12。1H-NMR（400MHz, DMSO-d6） ：8.14（1H, d, J=5.6Hz, H-6），6.44（1H,d,J=5.6Hz,H-5），2.50（1H,s,H-7），4.70（1H,d,J=7.6Hz,H-1'），3.57（2H,d,J=9.2Hz,H-6'），3.28（m,H-3'），3.32（m, H-5'），3.39（m, H-2'），3.42（m, H-4'），4.81（1H,d,J=2.8,H-1''），3.81（1H,d,J=2.2Hz,H-2''），4.24（1H, t, J=12.8Hz, H-4''），3.57（2H, s, H-5''）；13CNMR（100MHz, DMSO-d6） ：15.1（-CH3），174.2（C-4），161.5（C-2），155.8（C-6），141.7（C-3），116.1（C-5），109.1（C-1''），103.6（C-1'），78.8（C-3''），76.2（C-2''），75.8（C-4''），63.2（C-5''），75.8（C-3'），73.7（C-5'），73.2（C-2'），69.8（C-4'），67.4（C-6'）。上述信號歸屬是通過HMQC、H-H COSY、HMBC 二維核磁共振譜完成的。以上理化常數(shù)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)、1H-NMR、13CNMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]一致，故化合物1 鑒定為麥芽醇-6'-O- -D-呋喃芹糖基- -D-吡喃葡萄糖苷（maltol-6'-O- -D-apiofuranosyl-glucop-yranoside）。

3.2 化合物2

室溫下為黃色油狀物，易溶于甲醇，10%硫酸-乙醇加熱顯色為紅棕色，三氯化鐵反應(yīng)陽性，說明該結(jié)構(gòu)為酚類化合物。1H-NMR（400MHz,DMSO-D6） ：7.73（2H, m, H-3'），7.69（2H, m, H-4', H-6'），7.65（1H, m,H-5'），4.24（1H, dt, J=6.4Hz, H-1），4.14（1H, dt,J=6.4Hz, H-2'），2.51（1H, m, H-3），1.67（1H, m,J=6.8Hz, H-7），1.42（2H, m,J=15.2Hz, H-2），1.31（4H,m, J=12Hz, H-4, H-5），1.23（2H, m, J=13.2Hz, H-6），0.93（3H,d,J=7.2Hz,H-8），0.89（3H,d,J=7.4Hz,H-9），0.86（3H, t, J=5.1Hz, H-10）；13C-NMR （100MHz,DMSO-d6）：167.0（C-1'），131.7（C-2'），131.6（C-3'），131.5（C-7'），128.6（C-4', C-5', C-6'），67.4（C-1），38.1（C-3），30.0（C-7），29.8（C-4），28.3（C-2），23.2（C-5），22.4（C-6），13.9（C-9），13.5（C-8），10.8（C-10）。1HNMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]一致，故鑒定化合物2為3,7-二甲基-正辛基-1-苯甲酸（3,7-dimenthyl-n-octan-1-ethyl benzoate）。

3.3 化合物3

室溫下為無色油狀物，易溶于甲醇，微溶于水，10%硫酸-乙醇加熱顯色為淡黃色，三氯化鐵反應(yīng)陽性，說明該結(jié)構(gòu)為酚類化合物。1H-NMR（400MHz,DMSO-d6） ：7.71（2H,m,H-2',H-6'），7.67（1H,m,H-4'），7.65（2H, m, H-3', H-5'），4.32（2H, t, J=6.4Hz, H-1），1.71（2H, m, H-2），1.47（2H , m, H-3），1.28（3H, t, -CH3）；13C-NMR（100MHz, DMSO-d6）：166.9（C-1'），131.6（C-7'），131.4（C-4'），128.6（C-5'），128.0（C-6'），69.7（C-1），29.9（C-2），22.0（C-3），13.5（C-4）。1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]一致，故鑒定化合物3 為苯甲酸丁酯（butyl benzoate）。

3.4 化合物4

室溫下為黃色粉末，易溶于甲醇，10%硫酸-乙醇加熱顯色為黃色，三氯化鐵反應(yīng)陽性，說明該結(jié)構(gòu)為酚類化合物。1H-NMR（400MHz,DMSO-d6） ：7.71（2H,m, H-2'），7.68（1H, m, H-6'），7.28（1H, d, H-3'），4.23（2H,t,J=6.4Hz,H-1'），0.94（3H,t,J=5.2Hz,H-2'）；13CNMR（100MHz, DMSO-d6） ：167.1（C-1），131.8（C-2,C-6），128.6（C-3, C-5），126.3（C-7），65.2（C-1'）, 28.9（C-2'）。1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]一致，鑒定化合物4 為苯甲酸乙酯（ethyl benzoate）。

3.5 化合物5

室溫下為白色粉末，易溶于甲醇，微溶于水，10%硫酸-乙醇加熱顯色為紫色，三氯化鐵反應(yīng)陽性，說明該結(jié)構(gòu)為酚類化合物。1H-NMR（400MHz,DMSO-d6）：7.43（2H, d, J=6.4Hz, H-2, H-3），6.84（1H, d,J=8.4Hz, H-6），3.90（3H, s, H-8）；13C-NMR（100MHz,DMSO-d6）：150.8（C-4），147.1（C-5），122.7（C-6），122.4（C-2），114.9（C-3），132.2（C-1），55.5（C-8）。1HNMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]一致，故鑒定化合物5 為香草酸（vanillicacid）。

3.6 化合物6

室溫下為白色粉末，易溶于甲醇，微溶于水，10%硫酸-乙醇加熱顯色為棕色，三氯化鐵反應(yīng)陽性，說明該結(jié)構(gòu)為酚類化合物。1H-NMR（400MHz,DMSO-d6）：7.43（2H, d, J=6.0Hz, H-5, H-6），6.83（1H, d,J=8.4Hz, H-9），3.79（6H, s, H-2, H-3）；13C-NMR（100MHz, DMSO-d6） : 167.6（C-4），150.8（C-7），147.1（C-8），123.3（C-4），122.4（C-5），114.9（C-6），112.7（C-9），55.5（C-3），48.6（C-2）。1H-NMR、13CNMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]一致，故鑒定化合物6 為香草酸甲酯（methyl vanillic acid）。

3.7 化合物7

室溫下黃色固體，易溶于甲醇，硫酸-乙醇加熱顯色為黃色，Molish 反應(yīng)陽性，說明該結(jié)構(gòu)中連有糖基。1H-NMR（400MHz,DMSO-d6） ：4.23（1H,d,J=2.4Hz,H-4'），3.52（1H,m,H-2'），3.69（1H,m,H-3'），3.53（1H,dd, J=8.0Hz, H-5'），7.62（1H, d, J=16.0Hz, H-8），7.01（1H, s, H-6），6.78（2H, s, H-7），5.40（1H, d, J=1.6Hz,H-1'）；13C-NMR（100MHz, DMSO-d6） ：123.4（C-5），114.8（C-7），143.7（C-8），147.6（C-1），115.8（C-6），123.4（C-5），147.6（C-1），119.0（C-4），166.8（C-9），107.5（C-1'），84.1（C-4'），74.8（C-3'），80.0（C-2'），59.9（C-5'）。1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12,13]一致，鑒定化合物7 為咖啡酸-1-O--L-呋喃阿拉伯糖苷（Caffeic acid-1-O--L-oxole-arbinoside）。

4 結(jié)果與討論

本研究運(yùn)用醇提法對采集自吉林省長春市雙陽區(qū)的荷青花全草植物進(jìn)行了處理，采用多種色譜分離技術(shù)對荷青花全草植物提取物進(jìn)行分離得到了7 個化合物，結(jié)合每個化合物的理化常數(shù)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)、1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)[6-10]，最終得到7 個單體化合物，分別為麥芽醇-6'-O- -D-呋喃芹糖基- -D-吡喃葡萄糖苷（1）、3,7-二甲基-正辛基-1-苯甲酸（2）、苯甲酸丁酯（3）、苯甲酸乙酯（4）、香草酸（5）、香草酸甲酯（6）、咖啡酸-1-O--L-呋喃阿拉伯糖苷（7）。1～7 化合物均是首次從荷青花全草植物中分離得到，其中化合物1 為罌粟科中首次分離得到。本試驗(yàn)的結(jié)果為進(jìn)一步探究該植物的藥理作用提供了科學(xué)依據(jù)，為荷青花的化學(xué)成分和藥理活性提供了一定的參考。