鯽聽覺特性研究

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(1.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院,遼寧 大連 116023； 2. 遼寧省海洋牧場工程技術(shù)研究中心，中國水產(chǎn)學(xué)會海洋牧場研究會，遼寧 大連 116023；3.中國水產(chǎn)有限公司，北京 100160)

隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的快速增長，魚類養(yǎng)殖福利問題正成為許多國家的研究熱點，研究魚類的聽覺特性就顯得尤為重要[1]。淡水音響馴化牧場的發(fā)展中，利用魚類的聽覺特性，在養(yǎng)殖業(yè)中使用魚群聲誘控制投餌技術(shù)，可減少飼料的沉積，提高飼料利用率[2]，從而較好地改善養(yǎng)殖水域環(huán)境，使淡水養(yǎng)殖魚類健康、快速發(fā)展。魚類的聽覺器官結(jié)構(gòu)，在功能上發(fā)揮著不同的作用。魚類的內(nèi)耳可感覺16～1300 Hz的振動[3-4]，它是由耳石、聽壺、聽覺毛細胞和神經(jīng)系統(tǒng)組成，其中聽覺毛細胞可以將聲信號轉(zhuǎn)換為電信號，從而被神經(jīng)系統(tǒng)識別[5]，耳石則可以辨別聲音振動的方向；鰾的主要作用是聲音的“共鳴箱”或“共振器”，對聲波振動起到強化作用，因其鰾的結(jié)構(gòu)不同，對聲音的敏感程度也不盡相同[6]，如具有韋伯氏器的鯉形目Cypriniformes和鲇形目Siluriformes魚類則在聽覺頻域上更為寬廣，最高可聽到2～5 kHz頻率的聲音；側(cè)線也是魚類的聽覺器官，一般分布于魚體兩側(cè)，并沿整個身體長軸，隨水平肌隔的走向分布直達尾部，呈線狀排列，頭部也有發(fā)達的側(cè)線器官[7]，魚類能夠通過側(cè)線感受到水體中的水流壓力、低頻振動、溫度變化等信號，一般側(cè)線能夠感覺到的低頻振動為10～150 Hz[4]。因此，魚類可利用以上聽覺器官，綜合地感知水體中的聲音[4,8]。

目前，關(guān)于魚類聽覺特性的研究主要集中在聽覺閾值[9]、環(huán)境噪聲對魚類聽覺的遮蔽效果、音頻辨別能力、聲源定位能力，以及對學(xué)習音的記憶力等[10-12]。其中，聽覺閾值是魚類最基本的聽覺特性，是指魚類剛能聽到聲音的最小聲壓值，通常是以聽覺閾值曲線圖的方式來表示，橫軸為頻率，縱軸為聽覺閾值，曲線的最低點表示整個聽覺敏感頻率范圍中的最敏感頻率所對應(yīng)的最小聲壓值[13]。根據(jù)曲線，不僅可以了解魚類在各種頻率下的聽覺閾值，而且還能判斷出它們的可聽頻率范圍。

Green等[14]提出，魚類的聽覺閾值只是一個相對閾值，可能隨著時間和生理狀態(tài)而改變，因此，測量魚類聽覺閾值的試驗方法至關(guān)重要。聽覺閾值的測定方法主要有心電圖法(Electrocardiograph，以下簡稱ECG)、聽覺腦干反應(yīng)法(Auditory brainstem response，以下簡稱ABR)和行為法(Behavior)。

ECG法，通過將聲和電刺激相結(jié)合，建立條件反射，使魚對聲音產(chǎn)生記憶，并根據(jù)心電圖變化判斷魚對聲音的反應(yīng)。20世紀70—80年代，英國科學(xué)家對魚類聽覺能力和行為反應(yīng)進行了大量觀察研究，Chapman[15]和Hawkins等[16-17]采用心電圖方法測量了太平洋鱈Gadusmacrocephalus、大麻哈魚Salmoniformes、鮐chubmackerel等對聲音的反應(yīng)，并出版了《Under Water Sound and Fish Behaviour》和《Sound Reception in Fish》等專著；國內(nèi)，侍炯等[18]進行了150 Hz矩形波斷續(xù)音對褐菖鲉Sebastisousmarmoratus音響馴化的試驗研究。

ABR法，是指從魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)出神經(jīng)的動作電位，根據(jù)其電位的變化判斷魚對聲音刺激的反應(yīng)。Kenyon等[19]首次使用ABR技術(shù)測得了魚類的聽覺閾值，指出ABR技術(shù)是一種非侵入性、無須復(fù)雜行為馴化、測量迅速、對魚體無損傷、試驗魚可重復(fù)利用的高效技術(shù)手段，從此該方法被廣泛應(yīng)用于魚類聽覺損傷研究[20-22]、聲暴露試驗等研究中[23-25]。

行為法是指將行為學(xué)和動物心理學(xué)的方法相結(jié)合，通過馴化來觀察魚類對聲音的行為反應(yīng)，以此判斷魚類的聽覺能力[26]。在早期行為學(xué)馴化試驗中[27-29]，在指定區(qū)域內(nèi)播放特殊的聲音，當魚靠近該區(qū)域時，給予魚以食物獎勵，以此來觀察研究魚類的聽覺能力。此方法的缺點是，當接近聽覺閾值時，魚的行為反應(yīng)模糊不清，無法精確測量。

鯽CarassiusauratusLinnaeus隸屬于骨鰾類魚，具有韋伯氏器[3]，常見于歐亞地區(qū)，廣泛分布于中國各地水域，是中國重要淡水經(jīng)濟魚類。本試驗中，以鯽為研究對象，分別采用ECG法和ABR法研究了鯽的聽覺特性，測定了其聽覺閾值和繪制了聽力曲線，并比較了兩種方法的優(yōu)、缺點和準確性，旨在為研究淡水魚類的聽覺特性提供理論參考，同時也為發(fā)展建設(shè)淡水音響馴化型牧場提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鯽購于遼寧省大連市某養(yǎng)殖場。試驗前，將試驗魚在室內(nèi)玻璃鋼水槽(4.5 m2.0 m1.0 m)中暫養(yǎng)5 d，水溫為14.4～15.1 ℃。試驗過程分別采用ECG法和ABR法，每個試驗選取20尾活力較好的試驗魚，共40尾，體質(zhì)量為262.6～321.8 g，體長為21.1～23.3 cm。

1.2 方法

注： a為揚聲器，b為試驗水槽，c為試驗魚，d為刺激電極，e為ECG電極，f為固定框架，g為海綿墊，h為噪聲解析系統(tǒng)Note: a,speaker; b,water tank; c,fish; d,stimulating electrode; e,ECG electrode; f,fixed frame; g,rubber mat; h,hydrophone directivity圖1 ECG法試驗裝置圖Fig.1 Test installation diagram of ECG method

ABR法試驗裝置由隔音室、聲刺激系統(tǒng)及數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)組成(圖2)。其中，隔音室同上；聲刺激系統(tǒng)采用水下?lián)P聲器(UW-30，中國)作為刺激聲源，距離魚頭部正下方35 cm處放置，水下?lián)P聲器由金屬網(wǎng)包裹；而后導(dǎo)入到放大器(D-75A，Crown，中國)；數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)包含TDT系統(tǒng)處理器(RZ6，美國)和TDT前置放大器(RA4LI，美國)，并結(jié)合計算機進行數(shù)據(jù)分析，同時用水下聲音測量系統(tǒng)(Aquafeeler Ⅳ，Roland，日本)對環(huán)境噪聲進行實時監(jiān)測，并通過SigGenRZ軟件進行圖像記錄與分析。

注： a為前置放大器，b為固定框架，c為水下?lián)P聲器，d為噪聲解析系統(tǒng)，e為減振沙，f為記錄電極，g為參比電極，h為接地線，i為試驗魚，j為試驗水槽Note: a, preamplifier; b, fixed frame; c, underwater speaker; d, hydrophone directivity; e,vibration attenuation sand; f,recording electrode; g, reference electrode; h, ground lead; i, fish; j, water tank圖2 ABR法試驗裝置圖Fig.2 Test installation diagram of ABR method

1.2.2 ECG測定方法 將試驗魚放于濃度為0.3 mg/L的魚安定(MS-222)麻醉水中，6～8 min后取出置于手術(shù)盤上，用直徑為1.0 mm的空心針從試驗魚左胸鰭下基部刺入，沿心臟壁深入后從右胸鰭上基部刺出，把外徑為0.5 mm的絕緣鍍銀線貫入刺針空心部后，拔出刺針，將剝?nèi)ソ^緣壁長為2.0～2.5 mm部分對準心臟部位，用于采集心跳信號，魚體兩側(cè)電極線用橡膠顆粒固定以防止電極錯位，而后將試驗魚放入水槽中特制的固定魚裝置上，電極線另一端與心電圖機采集電極相連；心電圖機另一根電極線置入水中以形成回路。試驗過程中，利用聲電結(jié)合方式對試驗魚進行馴化，分別在頻率為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000 Hz時，采用正弦波連續(xù)音對試驗魚進行聲音馴化，馴化采取放聲1 s后，立刻用6 V直流電以0.1 s間隔刺激試驗魚，隨后迅速打氧，以3 min作為一個馴化間隔，共馴化7次；而后在12個頻率中以聲壓級2～3 dB(re 1 μPa，下同)遞減方式減小放聲，通過示波器觀測試驗魚的心跳變化，并結(jié)合背景噪聲實時監(jiān)測系統(tǒng)判斷聽覺閾值，直至觀測到心跳受聲音刺激后無明顯變化，則為最小放聲聲壓的聽覺閾值。

1.2.3 ABR測定方法 首先，對試驗魚進行麻醉，在試驗魚背鰭基部注射濃度為4 μg/g(體質(zhì)量)的加拉碘銨(Sigma，G8134)肌肉松弛劑溶液，以防止肌肉運動所產(chǎn)生的噪聲干擾。1～2 min后，魚體僅能鰓蓋做輕微運動，軀干部無大幅度肌肉收縮，麻醉可持續(xù)為6～8 h。

取直徑為0.3 mm的兩根紅黑鋼電極(NE-S-1000/13/0.4，西安富德公司)，針長13 mm，直徑0.4 mm。紅色記錄電極(recording electrode)，從試驗魚頭骨中縫聽神經(jīng)上方刺入，黑色參考電極(reference electrode)從試驗魚聽神經(jīng)后方肌肉處刺入，電極線暴露部分長度均控制在2.0～3.0 mm，用于采集腦干反應(yīng)信號[30]。魚體用聚乙烯網(wǎng)片包裹固定，而后將試驗魚使用“L”形支架固定放置于水槽內(nèi)，電極線通過前置放大器與TDT相連。試驗過程中，利用SigGenRZ軟件放聲，分別在頻率為100、200、300、500、800、1000、1500、2000 Hz時，采用短純音對試驗魚進行聽覺閾值測定，測定時在8個頻率中以聲壓級5 dB遞減方式減小放聲，接近閾值時，以2 dB遞減，通過TDT系統(tǒng)觀測試驗魚的ABR波形圖像變化進而判斷魚的聽覺閾值，直至觀測到無法確定可識別和可重復(fù)的波形，則為最小放聲聲壓的聽覺閾值。試驗過程全程中進行環(huán)境噪聲監(jiān)測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差(mean±S.D.)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ECG圖像

2.1.1 馴化前 從暫養(yǎng)池中隨機挑選鯽1尾，利用單電極導(dǎo)出法將采集到的圖像傳輸?shù)叫碾妶D機，而后導(dǎo)入示波器中呈現(xiàn)，通過圖像采集的穩(wěn)定與否判斷是否用作試驗魚。圖3為未刺激時試驗魚的心電圖圖像，在20 s的時間段中出現(xiàn)16個心率周期，每個周期為(1.250±0.034)s，可判斷試驗魚的心跳約為48 次/min。

2.1.2 馴化時 圖4為試驗魚在進行聲電刺激時的心電圖圖像，在聲電刺激的作用下，試驗魚心跳會出現(xiàn)驟停現(xiàn)象，經(jīng)過短暫恢復(fù)后，試驗魚心跳逐漸恢復(fù)，其中恢復(fù)的時間會隨著電擊次數(shù)的增加而減短，如圖5所示。在第1次電擊時，心跳恢復(fù)周期為(8.200±0.095) s，隨著次數(shù)的增加逐次遞減，到第7次電擊時，心跳恢復(fù)周期為(4.970±0.067) s。試驗魚隨著電擊次數(shù)的增加，對電擊的適應(yīng)性逐漸增強。

圖3 無刺激時試驗魚的心電圖圖像Fig.3 ECG waveforms of crucian carp Carassius auratus Linnaeus without electrical stimulation

圖4 聲電刺激時試驗魚的心電圖信號Fig.4 ECG waveforms of crucian carp Carassius auratus Linnaeus exposed to electrical stimulation

圖5 試驗魚心率恢復(fù)周期隨電擊次數(shù)的變化Fig.5 Changes in heartbeat recovery cycle with electric shock times in crucian carp Carassius auratus Linnaeus

2.1.3 馴化后 試驗魚在建立條件反射后，對聲音刺激產(chǎn)生了記憶，在感受到聲音刺激后產(chǎn)生心率周期的變化，其心搏速率將自動放緩，以此預(yù)防隨之而來的電擊。試驗魚在受到刺激時心跳減慢，波形中兩波峰間的間距明顯變大，心率周期延長。如圖6所示，聲刺激(無電)時播放純音信號為1～2 s，試驗魚心跳發(fā)生變化明顯，心率周期明顯延長，表明試驗魚受到刺激。試驗魚受到聲刺激(無電)后，心律周期均發(fā)生明顯變化，如圖7所示，可以清晰地看出心率周期從反應(yīng)前的(1.250±0.034) s，延長至反應(yīng)后的(2.840±0.149) s。通過心電圖的變化，可判斷試驗魚是否受到了聲刺激。

圖6 受聲音(無電)刺激后試驗魚的心電圖圖像Fig.6 ECG waveforms of crucian carp Carassius auratus Linnaeus during reaction process

圖7 試驗魚未反應(yīng)時心率周期與對刺激反應(yīng)時心率周期Fig.7 Eccentricity cycles of crucian carp Carassius auratus Linnaeus with and without response

2.2 ABR圖像

本試驗中所用20尾鯽均測得ABR波形。整個試驗的ABR波形包括7～11個正向波峰，最大振幅出現(xiàn)在中間部分，波形的潛伏期與刺激聲音聲壓級變化有關(guān)。在同一頻率下，潛伏期隨聲壓級從高強度到低強度逐漸延長，即聲壓級越高潛伏期越短。鯽ABR波形的幅值，也隨著聲壓級降低而逐漸減弱。例如，在500 Hz刺激聲音條件下(圖8)，在重復(fù)1000次的基礎(chǔ)上，聲壓級為110 dB時鯽ABR波形的振幅值最大；將聲壓級繼續(xù)降低到80 dB時，鯽ABR波形的振幅值最?。焕^續(xù)衰減聲壓級時，則無法繼續(xù)獲得ABR波形。因此，認為500 Hz條件下鯽的聽覺閾值為(80.0±0.9)dB。

圖8 500 Hz聲刺激條件下鯽聽覺腦干反應(yīng)波形圖(1000次重復(fù)平均)Fig.8 Waveforms of ABR response of crucian carp Carassius auratus Linnaeus in 500 Hz acoustic stimulus (average of 1000 different waveforms)

2.3 鯽聽力圖

根據(jù)ECG法和ABR法所測鯽的聽覺閾值，繪制出鯽的聽覺敏感曲線(圖9)，用兩種方法測得鯽的聽覺敏感曲線整體均呈現(xiàn)出“W” 型趨勢，即在不同頻率段上鯽有多個敏感頻率，符合骨鰾魚類廣域頻率的聽覺特征。ECG法中，100～200 Hz頻率范圍內(nèi)，鯽的聽覺閾值為(98.00±0.84)～(115.00±0.72)dB，聽覺閾值較高敏感性差；在300～800 Hz頻率段，鯽的聽覺閾值呈現(xiàn)波動下降趨勢，最敏感頻率出現(xiàn)在800 Hz，對應(yīng)的聽覺閾值最小，為(70.00±0.55)dB；而后在800 Hz以上頻率段，聽覺閾值隨著頻率的增加而變大。

圖9 心電圖法和聽覺腦干反應(yīng)法測得的鯽聽覺閾值Fig.9 Audibility thresholds of crucian carp Carassius auratus Linnaeus measured by electrocardiogram and auditory brainstem response

ABR法中，聽覺閾值隨頻率增加而改變的趨勢與ECG法基本相似，最敏感頻率也為800 Hz，聽覺閾值為(76.00±0.50)dB?？傮w上，用ABR法所測聽覺閾值略高于ECG法，但兩者在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 ECG法和ABR法的優(yōu)缺點

在信號采集方面，ECG法需提前掌握心臟在魚體中的位置，以保證電極采集部分與心臟壁精準貼合，屬一種體內(nèi)侵入型試驗方法；而ABR法屬非體內(nèi)侵入型試驗方法，僅需掌握魚類頭骨中縫的聽覺神經(jīng)位置，適用范圍較廣[19]，對于鯽等紡錘形魚類來說，用ABR法采集信號過程更為簡便。在試驗中，ECG法需對試驗魚進行聲電刺激馴化，以使其對聲音形成記憶力，馴化過程繁瑣，而ABR法則不需要馴化[26]。

在結(jié)果測定方面，ECG法需人為反復(fù)測量心電圖中心跳間隔變化，直至觀測到心跳受聲音刺激后無明顯波動，則為最小放聲聲壓的聽覺閾值；而ABR法可通過計算機軟件實現(xiàn)上千次的平均，直至觀測到無法確定可識別和可重復(fù)的波形，則為最小放聲聲壓的聽覺閾值[26]，此法操作簡便，數(shù)據(jù)精準，但易受儀器性能和試驗環(huán)境影響，以及主觀因素所影響，即不同的實驗室所測的結(jié)果可能不同。

本試驗在兩種方法的對比中，100～200 Hz頻率范圍內(nèi)，ECG法所測鯽聽覺閾值小于ABR法，主要原因是ABR法是聽覺腦干區(qū)域?qū)β晧捍碳さ姆瓷?，而ECG法是全身聽覺器官對聲音刺激的反射，包括側(cè)線對粒子振動的感知。這與Kenyon等[19]和Kojima等[26]認為ABR法在頻率低于100 Hz時測量不精準的觀點相一致。Ladich等[25]使用ABR法和行為法，比較了金魚Carassiusauratus的聽覺敏感度曲線，并指出在相同條件下，魚類對聲音的行為反應(yīng)閾值比實驗室內(nèi)采用ABR法所測的聽覺閾值低。這是因為水粒子振動也是影響魚類聽覺的重要因素，ABR法僅僅是監(jiān)測魚類對聲壓的敏感度。Slabbekoorn等[31]在研究魚類聽覺閾值時建議，在相同聲音背景條件下，可以使用兩種或兩種以上方法進行魚類聽覺閾值測量。因此，本試驗中使用ECG法和ABR法兩種試驗方法對鯽進行聽覺閾值測量，試驗結(jié)果科學(xué)可信。

3.2 ECG法和ABR法測量結(jié)果比較

不同的試驗方法所測得的魚類聽覺閾值可能不同。Kojima等[26]針對鯉和金魚通過ECG法和ABR法進行比較。在低于1000 Hz頻率段內(nèi)，鯉用ABR法所測聽覺閾值低于ECG法，金魚則相反，ECG法相對較低；而在1000 Hz以上頻率段，鯉和金魚總體上ABR閾值低于ECG法。

這可能源于環(huán)境噪聲的掩蔽，或試驗裝置在水缸中的粒子運動的效果所造成的影響，甚至在相同的試驗中，相同頻率也可能導(dǎo)致閾值的變化。另外，ECG試驗中使用的麻醉劑量及電擊伏數(shù)所造成的影響，也可能引起心電圖閾值間的變化。而且在低頻率中，ECG法獲得的閾值可能會受側(cè)線對粒子振動靈敏度的影響(如大西洋鱈在100 Hz下敏感，馬蘇大麻哈魚在100～200 Hz下敏感)，以及受水槽中揚聲器產(chǎn)生的水粒子振動不均等[4,19]的影響，ABR檢測同步的神經(jīng)活動是在第八顱神經(jīng)和在顱骨表面腦干聽覺神經(jīng)核，ABR記錄內(nèi)耳聲壓反應(yīng)，它不能代表由水平線檢測到的近場粒子運動的影響。另外，儀器設(shè)備交流電的低頻聲和環(huán)境噪聲對腦干反應(yīng)也會產(chǎn)生影響。

本試驗中，用ECG和ABR兩種試驗方法測得的聽覺閾值結(jié)果總體上相差為(3.50±0.75)dB且無顯著性差異。因此，今后在研究魚類聽覺閾值時，應(yīng)當考慮這兩種試驗方法對結(jié)果的影響。

4 結(jié)語

本試驗中采用ECG法和ABR法對鯽的聽覺特性進行了測定。結(jié)果表明：用ECG法測得的敏感頻率范圍為300～1000 Hz，最敏感頻率為800 Hz，對應(yīng)聽覺閾值為(70.00±0.55)dB；頻率范圍方面ABR法與ECG法相近，最敏感頻率相同，聽覺閾值方面ABR法略高，為(76.00±0.50) dB。對比兩種方法的利弊，ABR法較ECG法操作簡便，但對環(huán)境要求較ECG法更高。對于養(yǎng)殖魚類來說，如果其生存環(huán)境中遭到環(huán)境噪聲的污染，其產(chǎn)量和品質(zhì)均會受到較大影響。為提高淡水捕撈效率，保護淡水生態(tài)環(huán)境，淡水牧場的建立已成為重要的解決手段之一，其中關(guān)鍵技術(shù)——音響馴化技術(shù)，需要具備完整的聲頻參數(shù)，以使效果達到最佳。鯽作為淡水牧場中重要的馴化品種之一，了解其聽覺特性是十分必要的。本試驗結(jié)果可為淡水養(yǎng)殖業(yè)中推廣聲誘集投餌、聲誘集捕撈等方面提供科學(xué)參考和數(shù)據(jù)支持。然而在此次試驗過程中，雖然有隔音設(shè)備來屏蔽噪音，但仍有部分噪聲及電源信號雜波等對結(jié)果產(chǎn)生影響；其次，在麻醉魚用藥劑量方面還有待探索；與此同時，還應(yīng)在聽覺敏感頻率范圍間開展更為細化的測定與研究。由于實驗室內(nèi)與實際水域有一定的差距，因此，在今后進行魚類聽覺閾值研究中，還應(yīng)當加強試驗魚的野外測定。