ＦＲＡＮＳ ＨＡＬＳ德國(guó)鳶尾組織培養(yǎng)及植株再生研究

武海峰 呂遠(yuǎn)達(dá) 鄭海霞 趙明晶 王家慶

摘要：以德國(guó)鳶尾（Iris germanica. L）FRANS HALS葉片、球莖作為外植體，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究探討不同激素及不同濃度組合對(duì)鳶尾愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽分化以及試管苗生根的影響，為鳶尾快速繁殖、種質(zhì)資源的保存及利用提供最優(yōu)的技術(shù)方法。結(jié)果表明，不同外植體滅菌時(shí)間也不同，葉片為3%次氯酸鈉3 min，球莖為3%次氯酸鈉5 min;鳶尾組培快繁的最適合外植體為球莖;鳶尾愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化的最適培養(yǎng)基配方為MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L，生根培養(yǎng)基為MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L，試管苗移栽基質(zhì)采用泥炭∶珍珠巖=8∶2，成活率達(dá)90%以上。

關(guān)鍵詞：鳶尾（Iris germanica. L）;組織培養(yǎng);外植體;植株再生

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.71+8.28? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）23-0223-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.055? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research on tissue culture and plantlet regeneration of Iris germanica ‘FRANS HALS

WU Hai-feng1，LYV Yuan-da2，ZHENG Hai-xia1，ZHAO Ming-jing1，WANG Jia-qing1

（1.Shenyang Institute of Technology，F(xiàn)ushun 113122，Liaoning，China;

2.Institute of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）

Abstract： Using the leaves and bulbs of Iris germanica 'FRANS HALS' as explants， orthogonal experiment was used to study the effects of different hormones and different concentration combinations on the induction of callus， adventitious bud differentiation and rooting of test-tube seedlings to provide an optimized method for rapid propagation， preservation and utilization of germplasm resources of the iris. The results showed that the sterilization time required for different explants was different. The leaves were 3% sodium hypochlorite for 3 min and the bulbs were 3% sodium hypochlorite for 5 min. The most suitable explants for appendix tissue culture were bulbs. The optimum medium for callus induction and bud differentiation of Iris was MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L; rooting medium was MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L; the substrate was peat∶ perlite=8∶2， and the survival rate was over 90%.

Key words： Iris germanica. L; tissue culture; explant; plantlet regeneration

德國(guó)鳶尾（Iris germanica. L）是鳶尾科鳶尾屬多年生草本，單子葉常綠植物。鳶尾葉片碧綠青翠，花形大而奇特[1]，宛若翩翩彩蝶，是庭園中的重要花卉之一，也是優(yōu)美的盆花、切花和花壇用花，其花色非常豐富，也可用作地被植物，有些鳶尾種類(lèi)的鳶尾是優(yōu)良的鮮切花材料。鳶尾花卉品種有幾千種，在北美和西歐鮮切花及優(yōu)良庭園品種的推廣多是通過(guò)快速繁殖供應(yīng)市場(chǎng)[2]。一般情況下，鳶尾主要靠根莖傳統(tǒng)的方法繁殖，但此方法繁殖效率低、品種混雜，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，嚴(yán)重影響了經(jīng)濟(jì)效益[3，4]。通過(guò)植物組織培養(yǎng)不僅可以快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗，還可以很高效地解決傳統(tǒng)繁殖中產(chǎn)生的問(wèn)題。參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)德國(guó)鳶尾組織培養(yǎng)的報(bào)道可以發(fā)現(xiàn)，德國(guó)鳶尾繁殖的研究結(jié)果較少且差異較大，德國(guó)鳶尾組織培養(yǎng)存在污染率高、不定芽誘導(dǎo)困難、繁殖效率低等問(wèn)題[5-7]。國(guó)內(nèi)德國(guó)鳶尾試管苗未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)[8]。本研究以?xún)?yōu)良耐寒純種德國(guó)鳶尾新品種FRANS HALS為試材，探討建立組培快繁體系的適宜條件，為其試管苗的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

德國(guó)鳶尾（Iris germanica. L）FRANS HALS由沈陽(yáng)工學(xué)院園藝設(shè)施中心研究室提供。

1.2? 方法

1.2.1? 鳶尾外植體的選取? 選擇生長(zhǎng)健壯的植株幼嫩葉片以及球莖作為外植體，首先用自來(lái)水沖洗干凈，剪去殘葉、根系，于10%洗衣粉溶液中浸泡30 min，并不斷攪拌，再用流水沖洗干凈，在純凈水中沖洗3次，置于超凈工作臺(tái)上。在接種前于75%乙醇中浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.3%次氯酸鈉溶液浸泡3～5 min后，無(wú)菌水沖洗3～5次，用無(wú)菌濾紙吸干水分，將外植體切割成1 cm×1 cm小塊作為接種的外植體。每個(gè)處理9瓶，每瓶3個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)7 d后調(diào)查污染情況，污染率=（污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%，死亡率=（死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。鳶尾球莖初代培養(yǎng)情況見(jiàn)圖1。

1.2.2? 愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化培養(yǎng)基的篩選? 取備用的外植體，消毒滅菌后，將外植體分別接入事先采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（表1）配制好的初代培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷和分化。將其放入人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，所設(shè)光溫濕條件均為最適宜條件。不同外植體部位（葉片、球莖）分別接種外植體20塊，每瓶2個(gè)外植體，重復(fù)3次，15 d繼代1次，20 d后統(tǒng)計(jì)出愈率。出愈率=（有愈傷組織形成的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。40 d后觀察記錄芽分化情況，統(tǒng)計(jì)分化率。分化率=（有芽形成的外植體數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)）×100%。鳶尾球莖愈傷組織與繼代單株不定芽分化情況見(jiàn)圖2。

1.2.3? 生根培養(yǎng)? 生根培養(yǎng)以NAA作為誘導(dǎo)激素，具體設(shè)計(jì)如表1所示。將2～3 cm長(zhǎng)的健壯芽切割下來(lái)，使之成為單株無(wú)根苗，然后接種至不同生根培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種20個(gè)芽，15 d后觀察根生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)生根率。生根率=（有根形成的芽數(shù)/接種芽數(shù)）×100%。當(dāng)繼代的組培苗長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)選取健壯的小苗切割接種到生根培養(yǎng)基中，然后放入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀況，當(dāng)根長(zhǎng)達(dá)到3 cm的時(shí)候，可將其進(jìn)行出瓶移栽。鳶尾試管苗的生根情況見(jiàn)圖3。

1.2.4? 組培苗的移栽與馴化? 當(dāng)根長(zhǎng)達(dá)到3 cm以上，芽長(zhǎng)3～4 cm時(shí)，采用閉口全光照煉苗。1周后，打開(kāi)瓶蓋，進(jìn)行開(kāi)口煉苗，并按時(shí)旋轉(zhuǎn)封口膜，2 d后，將封口膜取下并向三角瓶?jī)?nèi)注入少量水，放于通風(fēng)處。3 d后，取出組培苗移植到不同配比的基質(zhì)中進(jìn)行煉苗，基質(zhì)體積比分別是泥炭∶珍珠巖=8∶2、黑土∶珍珠巖=7∶3、田園土∶黑土=7∶3。塑料薄膜覆蓋保濕，并用遮陽(yáng)網(wǎng)遮光，15 d后調(diào)查移栽成活率。成活率=（成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)）×100%。

1.2.5? 培養(yǎng)基的配制及培養(yǎng)條件? 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每升加瓊脂7.5 g，蔗糖30 g，加入不同梯度激素，pH調(diào)至5.8，分裝于100 mL玻璃三角瓶中，加膜扎緊封口，然后放入高壓滅菌鍋中，121 ℃下滅菌20 min。放在溫度為（26±1） ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)，光照12 h/d。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同3%次氯酸鈉消毒時(shí)間對(duì)外植體接種的影響

由表2可知，隨3%次氯酸鈉處理時(shí)間的增加，外植體污染率顯著降低，處理5 min和處理8 min的污染率均較低，分別為18.5%和14.8%，處理3 min的死亡率則較低，為7.4%，而處理10 min時(shí)，對(duì)外植體損傷較大，死亡率為29.6%，顯著高于處理3 min，因此，采用3%次氯酸鈉消毒葉片的最佳處理時(shí)間為3 min。

由于鳶尾球莖在地下取出，雜菌比較多，因此3%次氯酸鈉處理時(shí)間應(yīng)比葉片延長(zhǎng)。由表3可知，處理5 min和處理8 min的污染率均較低，分別為29.6%和22.2%;處理10 min時(shí)對(duì)外植體損傷較大，死亡率為25.9%，顯著高于處理5 min，而處理5 min的死亡率則較比處理8 min低，為11.1%。因此，采用3%次氯酸鈉消毒球莖的最佳處理時(shí)間為5 min。

2.2? 不同培養(yǎng)基對(duì)外植體誘導(dǎo)愈傷組織的影響

按照正交設(shè)計(jì)進(jìn)行8組試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2種激素對(duì)于鳶尾的外植體誘導(dǎo)作用差異很大。從表4分析結(jié)果可知，在初代培養(yǎng)過(guò)程中，葉片、球莖兩種外植體均能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并且兩種外植體愈傷組織誘導(dǎo)率都很高，但球莖高于葉片;從正交試驗(yàn)的結(jié)果分析中可以得出最優(yōu)外植體為球莖。正交表中最好的方案為6號(hào)試驗(yàn)，也就是A2B1C2組合。鳶尾快速增殖的最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L。

2.3? 生根培養(yǎng)

當(dāng)增殖苗長(zhǎng)至3 cm左右時(shí)，在無(wú)菌條件下，切下帶少量愈傷組織的單芽，接種于預(yù)備好的生根培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)情況。10 d左右開(kāi)始生根，20 d后根長(zhǎng)1～2 cm，4號(hào)培養(yǎng)基上根系生長(zhǎng)速度較快。調(diào)查各培養(yǎng)基中根系生長(zhǎng)情況，各培養(yǎng)基均有生根，具體情況見(jiàn)表5。因此，確定最佳生根培養(yǎng)基為4號(hào)培養(yǎng)基，即MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L。

2.4? 煉苗移栽

待根生長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)，將小苗進(jìn)行煉苗、移栽、定植。移栽前首先要進(jìn)行透氣訓(xùn)練，然后將組培苗根系所黏附的培養(yǎng)基沖洗干凈，經(jīng)過(guò)馴化的組培苗，葉片已形成角質(zhì)層，可以有效地防止體內(nèi)水分的蒸發(fā)，抵抗外界雜菌的侵染。這時(shí)可以將其移栽到常用的基質(zhì)上，進(jìn)行常規(guī)管理。移栽結(jié)果表明，試管苗在珍珠巖中移栽成活率最高，達(dá)90%。

3? 討論

德國(guó)鳶尾組織培養(yǎng)的外植體常采用莖尖或花的器官[9]，不僅存活率低，而且對(duì)母株的傷害比較大，因此不適宜作離體培養(yǎng)的外植體[10]。本試驗(yàn)利用葉片、球莖為外植體進(jìn)行德國(guó)鳶尾組織培養(yǎng)，與莖尖為外植體相比，球莖作初代培養(yǎng)的外植體具有取材方便、材料豐富、消毒方便、不損傷母本植株、能保存母本品種優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)。

激素對(duì)細(xì)胞的分化起著重要的調(diào)節(jié)作用，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例控制著細(xì)胞的分化和器官的形成，高質(zhì)量濃度細(xì)胞分裂素與低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素有利于芽的形成;反之則促進(jìn)生根。6-BA是植物組織培養(yǎng)常用的細(xì)胞分裂素[11]，NAA是常用的生長(zhǎng)素，本研究在MS中加入NAA和6-BA濃度配比的培養(yǎng)基，外植體均能發(fā)生愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化均在同一種培養(yǎng)基上進(jìn)行。鳶尾葉片與球莖外植體分化芽的能力取決于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的濃度比例。本試驗(yàn)中，愈傷組織的分化率在兩種激素的不同濃度組合間存在很大的差異。

在煉苗試驗(yàn)過(guò)程中，試管苗的成活率受諸多因素的影響，鳶尾移栽成活率在很大程度上取決于栽培基質(zhì)，3種不同栽培基質(zhì)對(duì)植株成活率影響不同。應(yīng)選擇易取得、好用、通風(fēng)排水佳、不易酸化腐爛和易植且便宜的栽培基質(zhì)。

4? 結(jié)論

本試驗(yàn)以德國(guó)鳶尾葉片、球莖為研究對(duì)象，研究不同激素及其不同濃度組合對(duì)鳶尾葉片、球莖愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽分化及其生根的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體選擇過(guò)程中，以球莖作為外植體繁殖系數(shù)最大，成活率最高。鳶尾快速增殖的最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L，生根培養(yǎng)基為MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L，試管苗煉苗基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖=8∶2，成活率達(dá)90%以上。該研究結(jié)果為鳶尾快速繁殖試管苗的有效途徑，可為鳶尾種苗的工廠化生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

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