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    硒代蛋氨酸對慢性低氧大鼠缺氧誘導因子1α、血管內(nèi)皮生長因子的影響*

    2019-01-11 03:24:22王樹林王秀娟
    關(guān)鍵詞:肌原纖維蛋氨酸低氧

    趙 宏,李 斌,劉 燕,王樹林,趙 磊,王秀娟

    (青海大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生系,西寧 810001)

    缺氧誘導因子1α(hypoxia indu-cible factor 1α,HIF-1α) 屬于核轉(zhuǎn)錄因子,對機體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)起維持作用。HIF-1α可調(diào)控機體內(nèi)100多種基因的表達[1]。在心臟疾病中,心肌均存在不同程度的缺血、缺氧,HIF-1α表達的增加是機體適應(yīng)心肌缺血缺氧產(chǎn)生的代償,可激活細胞膜上的酸敏感因子通道,造成心肌缺血損傷等[2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可有效促進血管生成,動物實驗證實其對缺血性心臟病有積極治療作用[3]。有研究證實Se-Met對缺氧大鼠血管活性物質(zhì)有影響[4],可以改善缺氧損傷。本研究擬探討慢性低氧條件下,補Se-Met對大鼠血漿HIF-1α、VEGF水平的影響,以及對大鼠心肌細胞線粒體形態(tài)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物

    SD大鼠90只,SPF級,體重200 g左右,由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[合格證號:SCXK(甘)2015-0002]。

    1.1.2 試劑儀器

    ELISA試劑盒由上海華壹生物科技有限公司提供。多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司,型號為Infinite M200 PRO。低壓氧艙購自貴州風雷航空機械有限公司,型號為DYC-3000。透射式電子顯微鏡購自日本日立(HITACHI)公司, 型號為H-7650。超薄切片機購自德國Leica公司,型號為UC7。

    1.2 研究方法

    1.2.1 硒代蛋氨酸添加方法

    硒代蛋氨酸添加量按照成年人每日硒的參考攝入量(60μg/d)進行折算,分成3個劑量組,第1組飼料中硒加入量為參考攝入量的5倍,第2組為10倍,第3組為20倍。

    1.2.2 實驗動物分組方法

    SD大鼠分成9組(每組10只)。根據(jù)不同海拔(3000m和5000m)設(shè)組,每個海拔再分成4組:低氧3 000 m對照組(簡稱30組)、第1組(簡稱31組)、第2組(簡稱32組)、第3組(簡稱33組);低氧5 000 m對照組(簡稱50組)、第1組(簡稱51組)、第2組(簡稱52組)、第3組(簡稱53組);同時設(shè)常氧對照組(簡稱00組)。

    對照組喂飼普通飼料,加硒組喂飼不同劑量加硒飼料。

    1.2.3 實驗方法

    將大鼠分別置入模擬海拔3 000 m和5 000 m的低壓低氧艙30 d。實驗結(jié)束后取大鼠血(經(jīng)腹主動脈)及內(nèi)臟,血液放入EDTA抗凝管內(nèi),離心(3000r/min,10min),血漿及心臟置液氮保存。采用ELISA法測定大鼠血漿HIF-1、VEGF水平。采用電鏡觀察心肌細胞線粒體改變,動物處死后取心肌組織切成1 mm3的小塊,立即置于2.5%的戊二醛固定液中(4℃)固定2小時以上,用0.1 M磷酸緩沖液浸洗30 min、1%四氧化鋨固定液4 ℃后固定2小時、乙醇梯度脫水、還氧丙烷置換10 min、環(huán)氧樹脂Epon812浸透包埋,在聚合后做半超薄切片(1~2μ)、美蘭染色后在光學顯微鏡下定位,用超薄切片機進行切片(50~70nm),用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后,在透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。

    1.2.4 統(tǒng)計學方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。所有結(jié)果用均數(shù)±標準差表示,多組間均數(shù)比較用方差分析,兩兩比較用t檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1 各組低氧大鼠血漿HIF-1α水平比較

    對00組、30組、50組進行總體及兩兩比較,P<0.05,3個對照組間差異有顯著性,說明慢性低氧對HIF-1α水平有影響。海拔3 000 m的4個組間比較,F(xiàn)=4.254,P<0.005。30組與32組(P=0.015)、31組與32組(P=0.002)、32組與33組(P=0.041)的差異均有顯著性(P<0.05)。低氧對照組HIF-1α水平高于補硒各組,補硒降低了HIF-1α水平,以32組下降明顯。海拔5 000 m的4組間比較,F(xiàn)=4.165,P<0.005。50組與52組(P=0.017)、51組與52組(P=0.004)、51組與53組(P=0.039)的差異均有顯著性(P<0.05)。低氧對照組HIF-1α水平高于補硒各組,補硒降低了HIF-1α水平,以53組下降明顯。不同海拔組間可見HIF-1α水平隨補硒量的增加而降低,5 000 m補硒各組下降明顯(表1)。

    表1不同海拔低氧大鼠血漿HIF-1α、VEGF水平(ng/L)

    Table 1Plasma HIF-1α and VEGF levels at different altitudes in hypoxic rats(ng/L)

    2.2 各組低氧大鼠血漿VEGF水平比較

    對00組、30組、50組總體比較,P<0.05,3個對照組間差異有顯著性,說明慢性低氧對VEGF水平有影響。海拔3 000 m組間比較,補硒各組VEGF水平均低于對照組,隨補硒量增加而降低。海拔5 000 m組間比較,50組與52組(P=0.041)、51組與53組(P=0.048)、52組與53組(P=0.013)的差異均有顯著性,補硒組VEGF水平高于對照組。不同海拔組VEGF水平均低于常氧對照組,VEGF水平隨補硒量增加而降低(表1)。

    2.3 00組、50組、52組低氧大鼠心肌細胞線粒體改變(圖1)

    00組 ×10000 50組 ×10000 52組 ×10000

    圖1示,00組大鼠心肌細胞體積較大,細胞核形狀多不規(guī)則,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻;肌原纖維排列基本整齊,肌節(jié)基本完整;肌原纖維間線粒體豐富,線粒體體積較大,嵴密集。50組大鼠心肌細胞核形狀不規(guī)則;肌原纖維間線粒體腫脹明顯,線粒體嵴間隙增寬,部分線粒體嵴溶解成空泡狀;部分肌原纖維排列不整。52組大鼠心肌細胞核形狀多不規(guī)則,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,肌原纖維排列基本整齊,肌原纖維間線粒體腫脹程度明顯減輕。補硒組大鼠心肌細胞線粒體的形態(tài)明顯接近于常氧對照組,對慢性低氧大鼠補充Se-Met明顯減輕了低氧對心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響。

    3 討論

    HIF-1α對機體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)起維持作用,可與其他信號通路形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng),在細胞增殖、血管形成與重塑等方面發(fā)揮著重要作用[1]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧對照組大鼠血漿HIF-1α水平明顯高于常氧對照組,HIF-1α水平在低氧條件下上升,不同海拔各組大鼠飼料中補充硒代蛋氨酸后HIF-1α水平有不同程度下降,在3 000 m和5 000 m組均以中硒劑量組(32組,52組)HIF-1α水平下降明顯。

    HIF-1α能保護缺氧心肌,但其過度、持續(xù)激活會惡化心功能,導致心肌肥厚。心臟特異性過表達HIF-1α會降低肌質(zhì)網(wǎng)鈣-ATP酶蛋白,導致患者發(fā)生心肌?。怀掷m(xù)增加的HIF-1α也會降低缺血性心臟病患者的心功能[5]。李永旺[6]認為,HIF-1α在動脈粥樣硬化、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)所致的氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,抑制HIF-1α的表達能減輕心力衰竭患者全身的炎癥反應(yīng),改善血管內(nèi)細胞的功能狀態(tài)。因此慢性低氧條件下適當補充硒代蛋氨酸能夠有效降低HIF-1α水平,減少缺氧條件下持續(xù)增加的HIF-1α對心臟組織造成的損害。

    VEGF是內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂源,低氧后VGEF表達的上調(diào)具有重要的病理生理意義[7]。本研究發(fā)現(xiàn)不同海拔各組大鼠飼料中補充硒代蛋氨酸后VGEF水平有不同程度下降,在3 000 m和5 000 m組均以高硒劑量組(33組,53組)VGEF水平下降最為明顯。侯文艷等[8]發(fā)現(xiàn),VEGF促進新血管形成,作用于肺小動脈內(nèi)膜后,引起內(nèi)膜增厚及介導新血管形成,肺動脈壓力升高后,增加了右室后負荷而影響了心臟的結(jié)構(gòu)和功能。同時,HIF-1α可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子,促進血管生成[9]。慢性低氧條件下通過補充硒代蛋氨酸能夠降低VGEF水平或通過減少HIF-1α來調(diào)節(jié)VGEF水平,減少了肺動脈高壓發(fā)生,進而減少了對心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響。

    線粒體是真核細胞產(chǎn)生ATP,進行能量代謝的重要場所。心肌細胞持續(xù)不斷地收縮舒張,需要消耗大量的能量,線粒體的分布、形態(tài)變化以及數(shù)量的改變不僅是其保持自身功能穩(wěn)定性的基礎(chǔ),還在保持細胞正?;顒又邪缪葜浅V匾慕巧玔10]。本研究通過電鏡觀察各組大鼠心肌細胞線粒體形態(tài)發(fā)現(xiàn),補硒組大鼠心肌細胞線粒體的形態(tài)接近于常氧對照組,對慢性低氧大鼠補充Se-Met明顯減輕了低氧對心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響,改善了心肌細胞的能量供應(yīng),降低了低氧對心臟功能的影響。

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