高原三倍體虹鱒石蠟切片制作方法的改良與驗證※

韓步鷹，李長忠，馬 睿，劉小紅，千康康，侯建華，東國才，陳殊婷，孟玉瓊

(青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧，810016)

石蠟切片制備步驟繁多，制備過程包括組織取材、固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、脫蠟、染色及封存等步驟。根據不同組織結構特點不同導致其制備方法也不盡相同。有研究表明，脫水和透明程序是石蠟組織切片制作中至關重要的環(huán)節(jié)，也是影響組織形態(tài)學研究的重要因素[1]。因此，要制出優(yōu)質的石蠟切片，需要不斷的摸索和改進制備條件。

本研究通過優(yōu)化制作的高原三倍體虹鱒不同組織石蠟切片，觀察高原三倍體虹鱒鰓、肝臟和腸道組織的基本組織形態(tài)學特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)方法

將固定好的組織用水多次沖洗去除固定液，分別按照不同程序進行組織的脫水和透明(見表1)。

表1本研究所采用的脫水及透明時間(min)

Table 1Dehydration and transparency time used in this study(min)

透明后的組織于60 ℃浸蠟2 h并包埋，修塊后采用切片機(LEICA，RM2235)將蠟塊切成6 μm厚的薄片，貼片和烤片后采用蘇木精-伊紅進行染色，染色步驟如下：

(1)脫蠟水化：將烤干的切片分別放入以下溶液中并保持一定的時間：二甲苯(Ⅰ)5分鐘、二甲苯(Ⅱ)5分鐘、無水乙醇5分鐘、95%乙醇2分鐘、80%乙醇2分鐘、70%乙醇2分鐘和蒸餾水2分鐘。

(2)染色：對于上述處理好的樣品，用蘇木素染色5分鐘，自來水沖洗數次洗去殘留的染色液后用蒸餾水洗滌。再以1%鹽酸酒精分化液分化30秒，期間用顯微鏡檢查，當其分色鮮明時用流水沖洗切片數次。放入伊紅染色溶液中染1分鐘。

(3)脫水和透明：將切片依次浸入95%酒精(Ⅰ)、95%酒精(Ⅱ)、100%乙醇(Ⅰ)和100%乙醇(Ⅱ)中停留1分鐘，然后將切片放入等體積比的無水酒精和二甲苯、二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)中，分別停留1分鐘。

(4)封存：將含組織材料的載玻片從二甲苯中取出放在吸水紙上，用膠頭滴管吸取中性樹膠滴在切片的中央，用小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍微傾斜使其左側與封藏劑接觸，緩慢放下蓋玻片，盡量減少氣泡的產生。最后將封好的切片放在托盤于37 ℃的恒溫箱中干燥后進行觀察。

1.2.2 優(yōu)化方法

參考以上常規(guī)方法，首先讓組織脫水脫過，得出最短透明時間；然后，不斷縮短組織的脫水時間，直至組織不能在二甲苯中透明，前一步時間即最短脫水時間；最后通過切片染色來判斷實際的效果。優(yōu)化后的脫水及透明程序見表2。

表2不同組織最佳脫水及透明時間(min)

Table 2Optimal dehydration and transparent time of different tissues(min)

2 結果與分析

2.1 不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒腸道組織顯微結構的影響

注：A1、B1和C1分別代表A、B和C處理組10倍物鏡下組織切片顯微結構圖； A2、B2和C2分別代表A、B和C處理組40倍物鏡下組織切片顯微結構圖。
圖A1：1-漿膜；2-肌層；3-粘膜下層；4-粘膜層；圖A2：1-固有層；2-上皮細胞；3-杯狀細胞。

圖1不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒腸道組織的影響

Figure1EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresontheIntestinalTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒腸道組織的影響如圖1所示，A處理組鏡下組織結構完整，厚薄均勻、無裂痕，染色鮮艷，細胞形態(tài)清晰。漿膜、肌層、上皮細胞和杯狀細胞等顯微結構清晰可見。B處理組鏡下組織產生脆裂，染色不均勻，漿膜和肌層中間產生空隙分層，有粘膜層脫落，組織結構不完整。C處理組鏡下組織產生嚴重裂痕，染色效果暗淡。

2.2 不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒肝臟組織顯微結構的影響

注：A1、B1和C1分別代表A、B和C處理組10倍物鏡下組織切片顯微結構圖；A2、B2和C2分別代表A、B和C處理組40倍物鏡下組織切片顯微結構圖。

圖2不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒肝臟組織的影響

Figure2EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresonLiverTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒肝臟組織的影響如圖2所示，A處理組鏡下組織產生皺縮現(xiàn)象，組織形態(tài)發(fā)生改變。B處理組鏡下組織形態(tài)清晰完整，染色鮮艷，無裂痕皺縮現(xiàn)象。C處理組10倍鏡下組織類似絮狀物，結構發(fā)生嚴重變形。

2.3 不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒鰓組織顯微結構的影響

注：A1、B2和C3分別代表A、B和C處理組10倍物鏡下組織切片顯微結構圖；A2、B2和C2分別代表A、B和C處理組40倍物鏡下組織切片顯微結構圖。
圖A2：1-呼吸上皮細胞；2-柱細胞；3-血竇。

圖3不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒鰓組織的影響

Figure3EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresonGillTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒鰓組織的影響如圖3所示，A處理組鏡下組織結構完整，染色鮮艷，細胞形態(tài)清晰。高倍鏡下呼吸上皮細胞、柱細胞和血竇清晰可見。B處理組鏡下組織產生脆裂，組織結構不完整，高倍鏡下鰓絲組織已經嚴重變形。C處理組部分鰓絲已經解體，染色效果暗淡。

2.4 最佳脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒不同組織的影響

注：A1、A2和A3分別代表腸道組織在物鏡為10倍、20倍和40倍下組織切片顯微結構圖。B1、B2 和B3分別代表肝組織在物鏡為10倍、20倍和40倍下組織切片顯微結構圖。C1、C2和C3分別代表鰓組織在物鏡為10倍、20倍和40倍下組織切片顯微結構圖。
圖A1：1 漿膜；2 肌層；3 粘膜下層；4 粘膜層；圖A3：1 固有層；2 上皮細胞；3 杯狀細胞；圖B2：1 肝細胞；2 肝血竇；圖C2：1 鰓小片；2 鰓絲；3 鰓絲軟骨；圖C3：1 呼吸上皮細胞；2 柱細胞；3 血竇。

圖4最佳脫水及透明程序對高原三倍體虹鱒不同組織的影響

Figure4EffectsofOptimalDehydrationandTransparencyProceduresonDifferentTissuesofPlateauTriploidRainbowTrout

對不同組織的石蠟切片制作程序優(yōu)化結果如圖4所示，最佳脫水和透明程序下的腸道、肝臟和鰓的組織切片薄厚均勻、無皺折、切面組織結構完整。細胞結構形態(tài)清晰，染色鮮艷，細胞核與細胞質藍紅對比明顯，腸道切片輕微縊縮，組織無裂隙。并且發(fā)現(xiàn)高原三倍體虹鱒鰓、腸道和肝臟組織脫水及透明時間存在差異，其中腸道組織所需脫水時間最短，肝臟組織透明時間最長。

3 討論

整個石蠟切片過程雖然并不復雜，但要制出優(yōu)質的切片，需要根據研究對象的不同，不斷的摸索和改進制備過程。脫水和透明程序是石蠟組織切片制作中至關重要的步驟，影響著最終切片質量的好壞。脫水的目的是把組織中的水分徹底脫除，有利于組織的透明、浸蠟及永久保存。通常采用梯度酒精浸泡逐漸取代組織中水分，以保證組織徹底脫水并避免組織過度收縮和硬化。然而，乙醇的濃度及處理時間會顯著影響生物組織的物理特性。長時間低濃度乙醇處理會導致組織變軟，助長材料的解體；而長時間高濃度乙醇處理則會導致組織收縮變硬[2]，進而產生脆裂乃至無法展片的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)鰓組織在B處理脫水及透明程序下明顯產生鰓絲解體現(xiàn)象，這可能由于在低濃度乙醇中每級停留時間太長，使組織變軟，C脫水和透明程序下，由于在高濃度乙醇中每級停留太長時間，使鰓組織產生收縮現(xiàn)象。肝臟組織在A處理脫水透明程序下明顯產生皺縮現(xiàn)象，這可能與脫水時間過短有關。

脫水后的材料在浸蠟前，還必須經過透明處理。透明是指采用透明劑置換組織內的脫水劑，透明與脫水環(huán)節(jié)息息相關，一般來說，脫水越充分，透明效果就越好[3]。隨著時間的推移，組織逐漸變得通透，最終呈透明狀，使得組織呈現(xiàn)透明狀以利于顯微鏡下觀察，同時為下一步的浸蠟起到橋梁作用，一般采用二甲苯進行。二甲苯不僅可替代組織中的酒精，又能溶解石蠟以利石蠟的滲入，是目前被廣泛應用的一種透明劑。然而，高濃度的二甲苯會引起組織強烈收縮[4]，所以要先用無水酒精與二甲苯等比例混合液進行透明預處理，再用二甲苯進行透明。且透明時間不宜過長，過長組織會出現(xiàn)脆裂現(xiàn)象，一般2小時左右即可[5]。本研究發(fā)現(xiàn)肝臟組織在A處理脫水透明程序下明顯產生皺縮現(xiàn)象，相反C脫水透明程序下出現(xiàn)脆裂現(xiàn)象，這可能與高濃度二甲苯中停留時間長短有關。

在對高原三倍體虹鱒石蠟組織切片制作方法研究的基礎上，本研究進一步對其鰓、肝臟和腸道組織進行形態(tài)學觀察。結果表明，高原三倍體虹鱒鰓組織由鰓弓和鰓絲組成，鰓弓由骨骼支持，每一片鰓由鰓弓、鰓耙及鰓絲構成，鰓絲呈長條形；肝臟組織主要由肝細胞構成，肝細胞多為多角形或近圓形，細胞核位于中央或偏移一側，少許細胞存在兩個細胞核；高原三倍體虹鱒腸道組織是由漿膜、肌層、粘膜下層和粘膜層構成的。粘膜層的中間是固有層、外圍由柱狀上皮細胞和杯狀細胞構成。

通過與其他魚類組織形態(tài)學研究對比發(fā)現(xiàn)，高原三倍體虹鱒組織形態(tài)結構與一般肉食性魚類如哲羅魚[6]、鱖魚[7]和黃鱔[8]等類似，而與草食性和雜食性魚類如鰱、鳙[9]和鯉魚[10]不同。一般來說肉食性魚類鰓耙短而稀疏，腸壁較厚，腸絨毛面積較大，肝細胞分布不均勻[11]。本研究發(fā)現(xiàn)高原三倍體虹鱒的鰓耙較稀疏，鰓絲呈長條形，腸壁較厚，杯裝細胞較多，長絨毛面積較大，肝臟不與胰臟混雜，肝細胞核呈圓形或橢圓形，有時可見兩個核，肝細胞索單列縱行，低倍鏡下似云霧狀，肝細胞分布不均勻，肝小葉區(qū)分不明顯。王永翠等[12，13]研究發(fā)現(xiàn)魚類消化道的形態(tài)組織結構與其生活環(huán)境和食物息息相關，食物豐富的魚類消化道杯狀細胞發(fā)達，與其組織結構上有更好的消化吸收機制密切相關。張娟娟等[14]在虹鱒的研究上發(fā)現(xiàn)腸絨毛面積與對營養(yǎng)物質的吸收相關。因此，不同養(yǎng)殖環(huán)境對于虹鱒組織形態(tài)學影響較大，系統(tǒng)研究高原三倍體虹鱒組織形態(tài)學對于理解其生理變化具有至關重要的意義。