青鏈霉素脅迫下甜菜堿對(duì)大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的影響※

姜枚辰，華玉美多，畢齊茂，許寶可，張得鈞

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016)

動(dòng)物身體中的正常菌群對(duì)外來(lái)細(xì)菌的大量增殖有著很強(qiáng)的抑制作用[1]。正常狀態(tài)下的菌群可以對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育起到良好的促進(jìn)作用，比如合成人體所需的維生素[2]。有研究表明，IHFA小鼠離乳前用阿莫西林處理導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)顯著改變，停藥至成年后菌群不能完全恢復(fù)[3]。抗生素濫用已成為引起動(dòng)物體內(nèi)菌群失調(diào)的重要原因，抗生素在殺死導(dǎo)致感染的有害細(xì)菌的同時(shí)，也損害了正常的體內(nèi)菌群，臨床上常表現(xiàn)為便次增多、水樣便、粘液便或膿血便等不同程度的菌群紊亂[4]。

甜菜堿有很強(qiáng)的藥理活性，具有很大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，是一種發(fā)展前景廣闊的化合物[5]。在干酪乳桿菌發(fā)酵中，甜菜堿可以起到與吐溫80相似的滲透保護(hù)作用，改善乳酸產(chǎn)量且無(wú)需改變?nèi)魏喂に嚄l件[6]。有研究指出甜菜堿可以提高微生物對(duì)高鹽高溫環(huán)境的抵抗能力，可以有效保護(hù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，而目前對(duì)甜菜堿的研發(fā)應(yīng)用主要集中在動(dòng)植物方面，對(duì)微生物影響的研究較少且結(jié)論不一[7-8]。因此本文對(duì)甜菜堿在脅迫條件(青鏈霉素)下對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室)。

1.1.2 主要試劑

甜菜堿(北京索萊寶科技有限公司)，Tryptone(廣州捷倍斯生物科技有限公司)，Yeast extract(oxoid公司)，NaCl(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)，青鏈霉素混合液(索萊寶生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(Thermo，MULTISKAN GO)，高壓滅菌鍋(HIRAYAMA，HEV-50)，雙層恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司，ZWYR-G2402)，無(wú)菌操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，LED-3)。

1.2 方法

1.2.1 LB培養(yǎng)基的配置

稱取Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，放置于1000 mL燒杯中，加入約800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，然后用去離子水將培養(yǎng)基定容至1000 mL。高溫高壓滅菌后，冷卻至室溫，4 ℃保存。

1.2.2 甜菜堿毒性試驗(yàn)

采用試管比濁法進(jìn)行試驗(yàn)：將11只帶棉塞的滅菌試管編號(hào)。按表1所示進(jìn)行培養(yǎng)基的配置。試驗(yàn)重復(fù)三次。將試管在搖床(37℃，220r/min)培養(yǎng)8 h后取200 μL培養(yǎng)液，于700 μm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果取平均值。

表1甜菜堿LB培養(yǎng)基配置表

Table 1Betaine LB medium configuration table

1.2.3 甜菜堿與青鏈霉素協(xié)同試驗(yàn)

采用試管比濁法進(jìn)行試驗(yàn)：取帶棉塞的滅菌試管15只，平均分為A、B、C三組。A組培養(yǎng)基內(nèi)加青鏈霉素，B組加不同濃度的青鏈霉素和一定濃度的甜菜堿，C組加一定濃度青鏈霉素和不同濃度甜菜堿，具體配置方法見(jiàn)表2，每組做3組平行研究，培養(yǎng)24 h后在700 μm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果取平均值。另取試管兩只，一只加培養(yǎng)基，另一只加培養(yǎng)基和菌液用作空白對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 甜菜堿組結(jié)果

在不同濃度甜菜堿(10～900μg/mL)條件下，大腸桿菌與枯草芽孢桿菌都表現(xiàn)為生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且不同濃度下其生長(zhǎng)情況無(wú)顯著性差異(P>0.05)。由此可見(jiàn)高濃度甜菜堿對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，甜菜堿對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌無(wú)毒性。數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表2甜菜堿與青鏈霉素組配置表

Table 2Betaine and Penicillin+Streptomycin Group Configuration

Table 3Results of Betaine toxicity

2.2 青鏈霉素與甜菜堿交互組結(jié)果

青鏈霉素對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌具有抑制作用，且隨著青鏈霉素濃度的增加抑菌能力逐漸增強(qiáng)。在20～100 μg/mL青鏈霉素條件下，加入250 μg/mL甜菜堿后大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的菌數(shù)均有了一定程度的增加，與不加甜菜堿的同濃度青鏈霉素組比較其生長(zhǎng)情況有顯著性差異，由此可見(jiàn)，在一定濃度的青鏈霉素脅迫下，甜菜堿可以起到保護(hù)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌的作用；在30 μg/mL青鏈霉素的影響下，革蘭氏陰、陽(yáng)性菌的菌數(shù)隨甜菜堿的濃度增加而增加，這反映了甜菜堿對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌具有一定的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用隨甜菜堿的濃度的升高而加強(qiáng)。證明甜菜堿可以對(duì)青鏈霉素產(chǎn)生拮抗作用，對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌有著較好的保護(hù)作用(表4)。

Table 4Results of betaine and Penicillin+Streptomycin

續(xù)表：

組別濃度(μg/mL)青鏈霉素甜菜堿n大腸桿菌24 h吸光度值枯草芽孢桿菌24h吸光度值青鏈霉素+甜菜堿(B)202590.412±0.01705?0.397±0.00863?602590.338±0.01625?0.364±0.00879?1002590.113±0.00580?0.086±0.00728?1402590.049±0.01034?0.048±0.01135?1802590.052±0.00328?0.046±0.00501?青鏈霉素+甜菜堿(C)30590.355±0.001243?0.360±0.00432?301590.363±0.001478?0.381±0.00514?302590.371±0.02430?0.389±0.00478?303590.380±0.002191?0.397±0.00701?304590.417±0.002762?0.405±0.00649?空白無(wú)菌組0010.0460.046正常組0010.4230.417F13.3875.479P<0.0010.004

*：與青霉素各不同濃度小組比較有顯著差異

3 討論

正常菌群被視為機(jī)體健康的確定原因，體內(nèi)菌群構(gòu)成的改變和菌群不平衡與健康狀況的改變有關(guān)[9]。菌群作為調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境的一個(gè)重要因素，影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝及免疫[10-12]。

抗生素的使用除了破壞正常菌群腸道定植抗力及影響菌群類別外，對(duì)整個(gè)腸道的微生物代謝環(huán)境及該微生態(tài)系統(tǒng)與宿主之間的相互作用也有影響[13]。相關(guān)的調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)的患者在住院期間有80%的人使用抗生素，而在英國(guó)則為22%；我國(guó)的住院患者有58%的人使用廣譜抗生素，或者聯(lián)合使用兩種或者兩種以上的抗生素，這比國(guó)際水平高出30%[14-15]。

本研究采用了試管比濁法，對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了測(cè)定。研究表明，甜菜堿對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，且甜菜堿在細(xì)菌不利生長(zhǎng)條件下(青鏈霉素作用下)對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌起到了明顯的保護(hù)作用。

在適宜細(xì)菌培養(yǎng)條件下，甜菜堿濃度在10～900 μg/mL時(shí)對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響，與空白組相比，革蘭氏陰、陽(yáng)性菌生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差別；在25 μg/mL甜菜堿的影響下，細(xì)菌在20～100 μg/mL青鏈霉素脅迫下，大腸桿菌與枯草芽孢桿菌的長(zhǎng)勢(shì)明顯好轉(zhuǎn)；在30 μg/mL青鏈霉素脅迫下甜菜堿對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌的保護(hù)作用隨甜菜堿濃度的增加而增強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，900 μg/mL的甜菜堿對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌無(wú)毒害作用，并且發(fā)現(xiàn)該濃度的甜菜堿對(duì)青鏈霉素起到一定的拮抗作用，這可能與甜菜堿具有的微生物的滲透調(diào)解機(jī)制有關(guān)，在雙抗存在的情況下甜菜堿可以對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌起到一定的保護(hù)作用。長(zhǎng)久以來(lái)甜菜堿被認(rèn)為是一種用來(lái)預(yù)防慢性病的安全高效的重要營(yíng)養(yǎng)素，這使得甜菜堿應(yīng)用于抗生素造成的腸道菌群紊亂成為可能[16-17]。本研究只闡述了甜菜堿對(duì)革蘭氏陰、陽(yáng)性菌的保護(hù)作用，該保護(hù)作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。