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    小鼠諾如病毒檢測方法團體標準的編制

    2019-01-11 04:43:18李曉波王淑菁王莎莎黃宗文賀爭鳴岳秉飛
    中國比較醫(yī)學雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:國家標準團體熒光

    李曉波,付 瑞,王 吉,王淑菁,王莎莎,李 威,秦 驍,黃宗文,賀爭鳴,岳秉飛

    (中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所,北京 102629)

    小鼠諾如病毒在實驗小鼠中有很高的感染率,其對動物本身及實驗結(jié)果均會產(chǎn)生較大影響,目前我國還沒有制定小鼠諾如病毒的相關(guān)標準。中國實驗動物學會結(jié)合實際需求提出了小鼠諾如病毒檢測方法團體標準的研究和撰寫,由中國食品藥品檢定研究院和廣東省實驗動物監(jiān)測所共同完成。本文介紹了該標準編制的背景、法律法規(guī)依據(jù),并對標準內(nèi)容的設置進行了解釋。

    1 編制背景

    2003年Karst等人通過腦內(nèi)連續(xù)傳代的方法,從死亡的先天免疫缺陷小鼠(RAG2-/-/STAT1-/-) 體內(nèi)分離得到一種新的病原體,經(jīng)鑒定該病原體屬于杯狀病毒科,諾如病毒屬,命名為小鼠諾如病毒1型(murine norovirus,MNV-1)。小鼠死于腦炎、腦膜炎、肝炎以及肺炎等致死性感染[1]。隨后其他MNV毒株相繼被分離,這些新發(fā)現(xiàn)的毒株其病原特性與原始分離株不盡相同[2]。

    MNV在實驗小鼠中有很高的感染率。其作為一種胃腸道病原體,主要通過糞口途徑傳播,也可經(jīng)呼吸道傳播,小鼠經(jīng)口感染MNV后可持續(xù)通過糞便向外排毒,排毒時間可達8周以上,病毒可在糞便中及潮濕物體表面存活40 d以上,同時各種品系小鼠均易感,因此很容易在實驗小鼠群體中形成爆發(fā)流行,據(jù)稱MNV是目前實驗小鼠中感染率最高的病毒,其感染率是排在第二位的小鼠細小病毒的10倍[3]。Masaaki等于2009年首次報道了MNV在日本的感染,其對來自6個實驗小鼠種群的37份小鼠糞便樣本進行檢測,MNV陽性率為22%(8/37)[4]。Kim等對來自韓國的15個動物設施的11個近交系或封閉群的745份小鼠血清調(diào)查表明,總MNV抗體陽性率為15%(112/745),其中包括內(nèi)部繁殖種群,外購動物及基因修飾動物[5]。Ohsugi對來自日本和美國的29個動物設施的96只小鼠調(diào)查表明,日本普通級小鼠和SPF級小鼠中MNV抗體陽性率分別為67.3%(37/55)和39.1%(9/23);美國普通級小鼠陽性率為62.5%(10/16),SPF級小鼠中未檢出(0/2)[6]。Charles River對客戶送檢的42000份小鼠血清中的MNV進行檢測發(fā)現(xiàn)其陽性率為32.4%[3]。Mahler等對來自西歐的100多個動物設施中實驗大、小鼠流行的24種病毒及支原體的檢測顯示,在眾多病原體中,MNV是感染率最高的病原體,陽性率為31.8%(2670/8394)[7]。我國MNV的感染情況也不容樂觀,袁文于2010年首次報道我國廣東省實驗小鼠MNV感染率為37.38(77/206),且不同設施來源的病毒基因型有差異[8]。中國食品藥品檢定研究院對2014和2015年來自全國17個實驗動物生產(chǎn)和使用單位的實驗小鼠進行了MNV的監(jiān)測,結(jié)果顯示MNV抗體陽性率為18.3%(204/1114),核酸陽性率為34.8%(181/520)[9]。有報道對北京地區(qū)的600只小鼠檢測顯示MNV感染率為11.67%,陽性小鼠主要來自動物實驗設施(陽性率30.94%),而商品小鼠的感染率僅為0.27%[10]。

    MNV的感染會對實驗動物造成很大危害。MNV感染會導致免疫缺陷小鼠(如Stat1-/-和IfnR-/-小鼠)組織發(fā)生系統(tǒng)性病變,導致肝、脾、肺、小腸等產(chǎn)生炎癥和壞死[11];免疫功能正常小鼠感染MNV后雖然大部分不表現(xiàn)臨床癥狀,但有報道野生型129小鼠在感染MNV后出現(xiàn)肝的輕到中度損傷,小腸淋巴結(jié)生發(fā)中心增大,脾紅髓增生,白髓活化等病理改變[12]。很多研究通過免疫組化,免疫熒光,原位雜交等方法證實MNV能夠感染不同組織里的巨噬細胞和樹突狀細胞,包括肝、肺、腸系膜淋巴結(jié)、腹膜、小腸、脾和主動脈等,說明不論免疫缺陷小鼠還是正常小鼠均可能發(fā)生MNV的全身性播散[13-15]。以上事實表明MNV感染對小鼠組織的損傷不容忽視。

    MNV的感染會對實驗結(jié)果產(chǎn)生較大影響。隨著對MNV研究的深入,MNV感染對實驗的影響越來越受到重視,一些研究表明MNV感染會對實驗造成一定影響,嚴重的會導致結(jié)果出現(xiàn)偏離。Doom等報道小鼠巨細胞病毒(MCMV)模型在同時感染MNV后,雖然并不影響MCMV的感染滴度也沒有引起MCMV的再活化,但會導致CD8+T細胞對MCMV的免疫優(yōu)勢表位的應答減弱[16]。Lencioni等發(fā)現(xiàn)MNV的急性感染可通過增強樹突狀細胞的抗原遞呈活性來改變腸炎小鼠模型的疾病進程,如會加重Mdrla-/-小鼠細菌性腸炎的進程,但對Smad3-/-小鼠影響不大[17-18]。還有報道發(fā)現(xiàn)MNV-1的感染會加重重復感染大腸桿菌小鼠模型的炎癥反應,導致其死亡率明顯提高[19]。有趣的是在某些動物模型中MNV的感染會對動物起到保護作用,Thepaut等報道MNV的共感染會延長綠膿桿菌所致急性肺損傷小鼠的存活期,減少體內(nèi)促炎因子的產(chǎn)生,但這也說明MNV的感染會顯著改變傳統(tǒng)動物感染模型的實驗參數(shù),從而導致錯誤的實驗結(jié)果[20]。

    鑒于MNV的上述特征,國際上的一些實驗動物權(quán)威監(jiān)管和檢測機構(gòu)如歐盟實驗動物科學聯(lián)合會(FELASA)、Charles River實驗室、杰克遜實驗室等均將其列為實驗小鼠的常規(guī)必檢項目[21],遺憾的是我國的實驗動物國家標準和其他相關(guān)標準均不包括MNV,為提高實驗小鼠質(zhì)量,適應我國目前實驗動物科學的發(fā)展水平和應用要求,與國際標準接軌,亟需制定小鼠諾如病毒檢測技術(shù)的相關(guān)標準。

    2 法規(guī)依據(jù)

    質(zhì)檢總局、國家標準委、民政部于2017年底發(fā)布的《團體標準管理規(guī)定(試行)》對團體標準的制定、實施和監(jiān)督進行了詳細的規(guī)定[22],第三條對團體標準進行了定義:“團體標準是依法成立的社會團體為滿足市場和創(chuàng)新需要,協(xié)調(diào)相關(guān)市場主體共同制定的標準”。小鼠諾如病毒檢測方法團體標準的制定均嚴格遵照該規(guī)定的要求執(zhí)行。

    《團體標準管理規(guī)定(試行)》第十三條“團體標準的編寫參照GB/T 1.1《標準化工作導則第1部分:標準的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定執(zhí)行”。本標準的編寫也嚴格參照了本導則的規(guī)定進行。

    本標準收集、整理了國內(nèi)外有關(guān)組織、地方和實驗動物專業(yè)生產(chǎn)公司的實驗小鼠諾如病毒檢測的先進標準,在研究分析質(zhì)量標準和控制要求的異同點后,在我國現(xiàn)有的實驗小鼠目前微生物質(zhì)量控制研究基礎之上制定。在確定本標準各項指標時,以國家科委第2號令《實驗動物管理條例》和國家科委與國家技術(shù)監(jiān)督局聯(lián)合頒發(fā)的《實驗動物質(zhì)量管理辦法》為依據(jù),同時參考了國家標準《實驗動物 微生物學等級及監(jiān)測》、《實驗動物 微生物學檢測方法》,以及國際公認的具有權(quán)威性的資料如FELASA及世界動物衛(wèi)生組織(OIE)等資料,使本標準的各項指標與國際水平接軌,符合國家標準的要求,使標準具有一定的可操作性。

    3 內(nèi)容編制

    3.1 檢測方法的設置

    隨著對MNV研究的深入,MNV的檢測方法也越來越趨于成熟,目前已建立和應用的主要實驗室檢測技術(shù)有病毒的分離和鑒定、免疫熒光法(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)及實時熒光PCR(qPCR)等。單一的檢測方法都有其優(yōu)缺點,考慮到既能檢測MNV抗原,又能檢測病毒抗體,我們參考了歐盟實驗動物科學聯(lián)合會(FELASA)有關(guān)MNV的檢測技術(shù)[21],在本團體標準中規(guī)定了病毒的分離培養(yǎng)、IFA、ELISA、PCR及qPCR等檢測方法?!秷F體標準管理規(guī)定(試行)》第十條規(guī)定:“團體標準的技術(shù)要求不得低于強制性標準的相關(guān)技術(shù)要求”。列入本標準的檢測方法主要有兩個來源,一是起草單位實驗室建立并驗證的方法,列入本標準的大部分方法均來自于此;另一部分是文獻報道的方法,這些方法經(jīng)起草單位實驗室驗證其敏感性、特異性及穩(wěn)定性等指標,選擇指標良好的方法列入本標準。沒有一種檢測方法是萬能的,每種方法都有其優(yōu)缺點及檢測的局限性:病毒的分離和鑒定多用于急性病例的確診,IFA 和ELISA主要用于檢測MNV抗體,ELISA可用于大量樣本的篩查,IFA可做確認試驗。PCR和實時熒光PCR用于檢測病毒核酸,準確快速,可在MNV抗體未出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)之前檢測到抗原,并且適用于不產(chǎn)生抗體的免疫缺陷動物中MNV的檢測,同時小鼠糞便作為檢測樣本,取樣方便,不需處死動物,符合實驗動物福利倫理的要求,因此目前應用較廣泛。這兩種方法相比,PCR方法操作簡便,但實驗操作較費時,并且PCR產(chǎn)物電泳步驟增加了交叉污染的風險;熒光PCR方法簡便快捷,樣品反應和結(jié)果觀察均在一個體系內(nèi)完成,減少了交叉污染的機會,被越來越多的廣泛應用,但成本較高。在實際應用中,可根據(jù)各個實驗室的檢測需求和實驗室的現(xiàn)有條件,從中選用1~2種方法應用即可。各種檢測方法如果有合適的商品化試劑也可購買使用,但必須對所購買的試劑進行質(zhì)控驗證。

    3.2 抗原檢測方法

    3.2.1 病毒的分離培養(yǎng)[23]

    病毒的分離培養(yǎng)作為病毒感染檢測的“金標準”,列入了本團體標準。MNV是第一個能在體外通過細胞進行分離培養(yǎng)的諾如病毒,本標準規(guī)定了MNV用RAW264.7細胞進行分離培養(yǎng)的技術(shù),RAW細胞分離自白血病病毒誘發(fā)的小鼠淋巴瘤,屬小鼠巨噬細胞系,易于傳代培養(yǎng),感染MNV后會產(chǎn)生明顯的細胞病變,目前已被廣泛用于MNV的體外培養(yǎng)分離。

    3.2.2 核酸檢測技術(shù)

    (1)普通PCR方法:目前熒光PCR作為一種主流的核酸檢測技術(shù),比普通PCR方法敏感性高1至2個數(shù)量級,且PCR產(chǎn)物無需瓊脂糖凝膠電泳,節(jié)省了實驗時間,并且減少了污染的幾率,有著普通PCR不能比擬的優(yōu)勢,但其儀器較貴,并且PCR試劑的合成費用較高,對一些還不具備熒光PCR實驗條件實驗室可采用成本較低的普通PCR方法。本標準所列的PCR方法包含單次PCR和套氏PCR兩種方法,單次PCR相比套氏PCR,PCR進行一輪擴增,所用時間短,但單次PCR的敏感性不如套氏PCR;套氏PCR敏感性高,但需要進行兩輪擴增,第2輪PCR反應是以第1輪的PCR產(chǎn)物為模板,因而增加了污染的幾率,容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。這兩種方法各有優(yōu)缺點,可根據(jù)實際情況任選一種即可。

    (2)熒光PCR:本標準所列的熒光PCR方法包含染料法[9]和探針法兩種方法,均可用來定量檢測MNV。染料法是在PCR反應體系中加入熒光染料,利用熒光染料能特異的摻入DNA雙鏈從而發(fā)射熒光信號,而單鏈DNA則不會摻入結(jié)合的特點,熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加成正比,通過檢查熒光信號來判斷是否有產(chǎn)物擴增。探針法主要是采用一條特異性探針,在其兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。在探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;而在有特異PCR擴增時,Taq酶的酶切活性將探針酶切降解,報告基團和淬滅基團分離,淬滅作用消失,因而產(chǎn)生熒光信號。從原理來看,染料法不含特異探針,只有一對特異性引物,其特異性會降低,因此結(jié)果判定需要結(jié)合溶解曲線來進行,但染料法的敏感性高于探針法,最低可檢測到10拷貝/μL MNV核酸。兩種方法也是各有優(yōu)劣,同樣可根據(jù)需要選擇一種方法即可。

    3.3 抗體檢測方法

    3.3.1 ELISA

    ELISA方法由于其操作簡便易行的特點,是目前實驗動物國家標準中檢測病毒抗體的主流方法,其操作步驟參考GB/T 14926.50-2001《實驗動物 酶聯(lián)免疫吸附試驗》。所用的檢測抗原既可以是重組抗原也可以是純化的病毒抗原,無論是重組抗原還是病毒抗原,都要求較高的純度。

    3.3.2 IFA

    在ELISA檢測為可疑結(jié)果的情況下(如OD值處于臨界值的情況),可用IFA進行確認實驗。本標準規(guī)定了MNV接種RAW264.7細胞的免疫熒光檢測方法,具體操作參照GB/T14926.52-2001 《實驗動物 免疫熒光試驗》。

    4 未來展望

    實驗動物被譽為生命科學研究中的“活天平”和“活試劑”,實驗動物質(zhì)量關(guān)系到科學實驗結(jié)果的可靠性和準確性,從而影響藥品質(zhì)量評價和人民群眾的身體健康,因此對實驗動物質(zhì)量尤其是微生物和寄生蟲等的預防與控制,顯得尤為緊迫和需要。

    我國目前對實驗小鼠的微生物監(jiān)測主要參照實驗動物國家標準“GB 14922.2-2011 實驗動物 微生物學等級及監(jiān)測”,其中對清潔級小鼠病毒規(guī)定檢測5項,SPF級小鼠在清潔級小鼠的基礎上增加6項。國家標準的歷次修訂均未考慮將MNV加入,這也造成了國內(nèi)大部分實驗小鼠的MNV感染情況處于無監(jiān)管狀態(tài),實際感染狀況堪憂,對實驗動物的質(zhì)量及實驗結(jié)果造成的潛在影響不容忽視。

    《團體標準管理規(guī)定(試行)》第二十五條“團體標準實施效果良好,且符合國家標準、行業(yè)標準或地方標準制定要求的,團體標準發(fā)布機構(gòu)可以申請轉(zhuǎn)化為國家標準、行業(yè)標準或地方標準”。本團體標準在將來的實施和實踐中也會不斷的改進和提高,隨著實驗動物科學的發(fā)展,實驗動物質(zhì)量標準要求的越來越高,團體標準轉(zhuǎn)化為國家標準或地方標準勢在必行,將成熟的經(jīng)實踐檢驗過的團體標準轉(zhuǎn)化為實驗動物的國家標準,從而填補國家標準中MNV檢測的空白,也是促進我們的國家標準與國際接軌,提高我國實驗動物質(zhì)量整體水平的必然要求。

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