CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在豬基因編輯中的研究進(jìn)展

李 尚，石 崗，馮韶華，張正敏，周一彤，蘆春蓮，曹洪戰(zhàn)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071001）

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由規(guī)律成簇間隔短回文序列（CRISPR）和CRISPR 相關(guān)蛋白9（Cas9）組成，廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，是機(jī)體長期進(jìn)化形成的由RNA 指導(dǎo)的降解外源遺傳物質(zhì)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。由于該系統(tǒng)可以識別靶向序列完成DNA 雙鏈切割，因此自2013 年起，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被改造為基因編輯工具，其具有設(shè)計簡單、特異性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，為基因組定向改造調(diào)控和應(yīng)用帶來了突破性革命，并在一些領(lǐng)域中得到廣泛研究和應(yīng)用。而因為CRISPR/Cas9 存在脫靶效應(yīng)和外源基因插入困難等問題，在一定程度上限制了CRISPR/Cas9 的應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的組成及功能 根據(jù)PSSM 矩陣庫（NCBI 提供）綜合分析基因組數(shù)據(jù)，在原來Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基礎(chǔ)上引入了新型Ⅳ和Ⅴ[1]。近年來根據(jù)CRISPR系統(tǒng)Cas 編碼的復(fù)合物將上述Ⅰ～Ⅴ分為“1 類”和“2類”。1 類系統(tǒng)具有多重亞基crRNA 效應(yīng)子復(fù)合物，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型CRISPR 系統(tǒng)，2 類系統(tǒng)的效應(yīng)子復(fù)合物都是Cas9，包括Ⅱ和Ⅴ型CRISPR 系統(tǒng)[2]。Ⅱ型（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)是CRISPR/Cas 系統(tǒng)中最簡單，也是目前研究最為徹底、應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)。

完整的CRISPR 位點(diǎn)依次包括Cas 基因、前導(dǎo)區(qū)以及由短回文重復(fù)區(qū)（repeat）和間隔區(qū)（spacer）構(gòu)成的CRISPR 序列。上游Cas 基因有豐富的多態(tài)性，編碼蛋白有核酸酶的功能；前導(dǎo)區(qū)可看作CRISPR 序列的啟動子，激活轉(zhuǎn)錄；下游CRISPR 序列中的回文序列一般21～48 bp，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；間隔區(qū)即細(xì)菌捕獲外源DNA，相當(dāng)于細(xì)菌建立“黑名單”，產(chǎn)生獲得性免疫[3-4]。

1.2 基因編輯技術(shù) 基因組特定位點(diǎn)的DNA 雙鏈斷裂（DSB）可以激活細(xì)胞內(nèi)部的修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而大幅度提高同源重組的效率。DNA 雙鏈斷裂，在DSB 處產(chǎn)生的非同源末端連接（NHEJ）和同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）修復(fù)機(jī)制可以對基因組進(jìn)行靈活修飾，預(yù)示了基因編輯的到來。為了在基因組特定位點(diǎn)引入DNA 雙鏈斷裂，多種定制化的核酸內(nèi)切酶被陸續(xù)開發(fā)應(yīng)用，主要包括鋅指核酸酶（ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。

相比于傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，ZFN 和TALEN 出現(xiàn)大大提高了基因打靶效率，并且高效地實(shí)現(xiàn)了對基因組的定點(diǎn)操作以及基因表達(dá)調(diào)控，如定點(diǎn)插入、刪除和替換、轉(zhuǎn)錄抑制或激活等，但由于操作復(fù)雜、成本高等特點(diǎn)限制了這兩項技術(shù)的發(fā)展。而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為第3 代基因編輯技術(shù)，相比于ZFN 和TALEN，有著無可比擬的優(yōu)點(diǎn)：CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以對所有基因組進(jìn)行編輯；具有可控性；可在1 個細(xì)胞內(nèi)同時進(jìn)行多個基因編輯，提高編輯效率；操作簡便，幾乎任何分子實(shí)驗室都可開展。但同時CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在脫靶效應(yīng)，這是由Cas9 蛋白能夠在sgRNA 與靶序列之間存在錯配的情況下繼續(xù)進(jìn)行識別導(dǎo)致的，目前可通過提高sgRNA 特異性、控制Cas9-sgRNA 用量、改造Cas9等改善CRISPR/Cas9 脫靶效應(yīng)[5]。

2 CRISPR/Cas9 在豬研究中的應(yīng)用

自2013 年CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)第1 次運(yùn)用到哺乳動物細(xì)胞以來，CRISPR/Cas9 技術(shù)發(fā)展迅速。豬作為一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動物，由于其在基因組、解剖、生理代謝和疾病特征以及器官大小和功能上與人類十分相似，因此也是非常理想的大動物模型。CRISPR/Cas9技術(shù)為豬遺傳改良、抗病育種、構(gòu)建人類疾病模型及異種器官移植等方面的研究提供了新的思路和手段，極大地推動了畜牧業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等方面的研究[6-7]。

2.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)加快豬遺傳改良 使用CRISPR/Cas9 技術(shù)對豬遺傳改良的研究通常會結(jié)合細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù)和胚胎移植（ET）技術(shù)的應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9 得到基因敲除或敲入豬對提高豬生產(chǎn)性能和加快遺傳改良等方面具有推動作用。

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）作為轉(zhuǎn)化生長因 子-β超 家 族（Transforming Growth Factor-βSuperfamily，TGF-β）的成員，是骨骼肌發(fā)育和生長的主要抑制劑[8-9]。在牛、綿羊和狗等動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSTN 天然突變在提高瘦肉率等肉質(zhì)性狀的同時也出現(xiàn)了一些副作用，如繁殖力降低、難產(chǎn)等。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生的編輯動物在表現(xiàn)出一些理想表型（如雙肌表型、快的生長率等）的同時，也出現(xiàn)了副作用。如歐洲豬種中產(chǎn)生的MSTN 突變、雜合體敲除豬表現(xiàn)出瘦肉率增加，并且背膘厚度減少，但是幾乎所有純合子敲除的仔豬都會表現(xiàn)出一些與健康有關(guān)的問題，并在出生后幾天內(nèi)死亡[8]。Wang 等[9]使用CRISPR/Cas9 和SCNT 在二花臉豬中產(chǎn)生MSTN 突變，表現(xiàn)出部分雙肌表型，如突出的肌肉、較寬的背部和臀部等，并且含有純合突變的二花臉豬不像大白豬一樣常出現(xiàn)健康問題。MSTN 敲除可能有助于提高中國本地品種的生產(chǎn)性能，但還需進(jìn)一步選擇育種。

胰島素樣生長因子2（Insulin-like Growth Factor 2，IGF2）是一種母系印記生長因子，通過與IGF1 受體（IGF1R）結(jié)合并激活下游信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡，以促進(jìn)骨骼肌生長。豬IGF2 內(nèi)含子3 內(nèi)的SNP 破壞阻遏物ZBED6（Zinc Finger BEDtype Containing 6）的結(jié)合位點(diǎn)，使骨骼肌中IGF2上調(diào)，并對肌肉生長、心臟大小和脂肪沉積產(chǎn)生主要影響。這種有利突變在西方商業(yè)豬群中常見，而在中國大多數(shù)本地品種中不存在。因此，Liu 等[10]以兩廣小花豬為研究對象，有效破壞豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFF）中IGF2 內(nèi)含子3 中的ZBED6 結(jié)合位點(diǎn)，再利用SCNT產(chǎn)生IGF2 編輯豬，明顯增強(qiáng)了肌肉發(fā)育，提高了兩廣小花豬的瘦肉率，豬的生活率雖符合預(yù)期，但大多數(shù)在早期死亡，也易感染地方性流行肺炎（Swine Enzootic Pneumonia，SEP），其中也由于缺乏護(hù)理經(jīng)驗，使SEP 豬早期死亡。Xiang 等[11]提到，由于每個基因通過與轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)相互作用發(fā)揮其獨(dú)特功能，敲除內(nèi)源基因除了獲得所需表型，還可能潛在地改變更多的表型；轉(zhuǎn)基因引入通常攜帶外源因子，這可能導(dǎo)致可預(yù)見的效果，該團(tuán)隊通過編輯巴馬豬IGF2內(nèi)含子3-3072 位點(diǎn)，不僅改善其肉產(chǎn)量，也第一次證明了編輯非編碼區(qū)可以改善家畜經(jīng)濟(jì)特征。Zheng 等[12]利用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的非同源重組整合外源片段的方式，通過SCNT 和ET構(gòu)建出解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）基因定點(diǎn)KI 豬（效率為11.5%），仔豬耐寒，成年后胴體品質(zhì)得到改善。

2.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)在抗病育種中的應(yīng)用 豬病頻發(fā)是當(dāng)前中國生豬產(chǎn)業(yè)面臨的重大問題，單純依靠防疫和藥物治療已無法徹底防控豬病。隨著動物基因組計劃研究的深入，有關(guān)疾病的致病基因、候選基因、QTL 不斷被揭示，用遺傳學(xué)方法從遺傳本質(zhì)上提高豬群的抗病力，開展抗病育種具有治本的功效，而CRISPR/Cas9為抗病育種的研究提供了思路和手段[13-14]。

豬繁殖與呼吸綜合癥（PRRSV）以妊娠后期母豬流產(chǎn)等繁殖障礙為主要特點(diǎn)。病毒只有通過表面特異性受體結(jié)合后才能進(jìn)入細(xì)胞，因此病毒相關(guān)受體對致病力影響很大。與PRRSV 相關(guān)的受體主要包括硫酸乙酰肝素樣物質(zhì)、唾液酸粘附素、CD163 以及某些未知受體。研究證實(shí)，CD163 是PRRSV 感染豬的必需受體，CD163 中的SRCR5 為PRRSV 感染所必需[15-16]。Whitworth 等[17]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)靶向2 種內(nèi)源基因（CD163和CD1D）和1 種轉(zhuǎn)基因（eGFP），通過顯微注射Cas9 mRNA 和sg RNA 及SCNT 獲得敲除CD163基因的編輯豬，但由于CRISPR/Cas9 在同一胚胎內(nèi)同時有效靶向2 個基因，難以確定單基因作用。王少華等[18]利用CRISPR/Cas9n 系統(tǒng)結(jié)合SCNT，成功獲得了2 頭正常存活的CD163基因編輯克隆豬。Burkard 等[19]在豬受精卵中敲除了CD163基因的外顯子7，這些豬表達(dá)缺乏SRCR5 的CD163 蛋白（ΔSRCR5 CD163），并表明ΔSRCR5 豬在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下是健康的，并且在保存PRRSV 抗性的同時保持CD163的生物學(xué)功能。

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（PRV）引起的豬急性傳染病，可引起妊娠母豬及新生仔豬發(fā)病，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。Xu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將純化的PRV基因共轉(zhuǎn)染到具有差的轉(zhuǎn)染效率的PK15 細(xì)胞中，其編輯的PRV基因獲得了高達(dá)100%的基因缺失病毒，可作為較好的載體用于疫苗研發(fā)。Tang 等[21]同樣對PRV進(jìn)行編輯，可阻斷病毒的復(fù)制，并有可能成為控制PRV 的新的有效手段。

豬圓環(huán)病毒血清型2，即PCV2 為致病性病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原。在信號傳導(dǎo)途徑中，p53 信號傳導(dǎo)對于控制靜止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA 復(fù)制至關(guān)重要。研究表明PCV2 的感染通過上調(diào)p53 誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡[22]。為了進(jìn)一步確定p53 信號在PCV2 感染過程中的作用，Xu 等[22]建立了p53 基因敲除PK15 細(xì)胞系，表明PCV2 感染通過激活p53 途徑誘導(dǎo)S 期積累，以促進(jìn)宿主細(xì)胞的病毒復(fù)制。但p53 信號傳導(dǎo)的確切分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

豬瘟由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染傳染病，具有高度傳染性和致死性，對豬危害極為嚴(yán)重。Xie 等[23]將shRNAs 敲入豬pROSA26 基因座，再通過SCNT 產(chǎn)生抗-CSFV 轉(zhuǎn)基因豬（TG），體外和體內(nèi)病毒攻擊實(shí)驗證明，這些TG 豬可以有效地限制CSFV 的復(fù)制并降低CSFV 相關(guān)的臨床體征和死亡率，且疾病抗性可以穩(wěn)定地傳遞給F1 代，但在TG 豬中觀察到一些臨床癥狀和病毒血癥。Lu 等[24]成功地將外源shRNA 整合到豬miRNA-17-92（pmiR-17-92）簇中，可以在pmiR-17-92 簇的內(nèi)源啟動子的控制下穩(wěn)定且有效地表達(dá)抗EGFP或抗CSFV shRNA。

隨著研究的進(jìn)一步深入，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與其他技術(shù)的結(jié)合必將推動抗病育種的研究?？共』蚓庉嬝i的制備不僅能為研究豬發(fā)病機(jī)制提供重要模型，而且能減少因疾病引起養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，推動養(yǎng)豬業(yè)的健康快速發(fā)展。

2.3 利用CRISPR/Cas9 技術(shù)建立人類疾病模型 豬在解剖學(xué)、生理病理學(xué)、營養(yǎng)代謝和疾病特征等方面都與人類相似度較高，基因修飾豬現(xiàn)已是疾病發(fā)生機(jī)制、病理毒理研究、治療藥物評估等眾多領(lǐng)域所需的重要動物模型。但是，大型基因修飾動物模型生產(chǎn)難度大、步驟繁瑣、耗時長、成本高昂。隨著基因編輯技術(shù)的突破，CRISPR/Cas9 技術(shù)大大提高了基因突變效率，降低了基因修飾動物模型的造模成本，同時簡化了步驟，推進(jìn)了基因修飾豬的廣泛應(yīng)用[25]。

目前，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和其他技術(shù)相結(jié)合成功建立了人類疾病的豬模型。使用血管性血友病因子（vWF）雙等位基因的巴馬小型KO 豬構(gòu)建了人類臨床Ⅰ型和Ⅱ型血管性血友病模型，但vWF突變會有嚴(yán)重的出血傾向，其出血時間高于野生型[26]。酪氨酸酶（TYR）雙等位基因KO 豬表現(xiàn)出了典型白化病癥狀[27]。人諾如病毒（HuNoVs）免疫缺陷型（RAG2/IL2RG KO）豬具有免疫缺陷特征，與野生型相比，RAG2/IL2RG缺陷豬感染時間延長[28]。通過敲除DJ-1、parkin及PINK1[27]，PARK2和PINK1[29]，E46K、H50Q及G51D[30]以期產(chǎn)生帕金森?。≒D）模型，均表明幾個月不足以使小型豬大腦發(fā)生類似PD 的病理變化，且7 個月時沒有觀察到帕金森病的典型癥狀。飼喂HFHC（30%飽和脂肪和1.5% 膽固醇，連續(xù)3 個月）日糧的ApoE KO 巴馬香豬模型表現(xiàn)出嚴(yán)重的高膽固醇血癥并發(fā)展為進(jìn)行性動脈粥樣硬化病變[31]；敲除Apo E與LDLR的基因編輯豬表現(xiàn)出與動脈粥樣硬化相關(guān)的異常脂質(zhì)代謝，為人類心血管疾病的研究建立有價值的動物模型[32]。Hoxc13 KO 豬產(chǎn)生的外胚層發(fā)育不良（Ectodermal Dysplasia-9，ED-9）豬模型，其表型與ED-9 患者表型相似，但也表現(xiàn)出異常表型，如毛囊數(shù)量減少等，其產(chǎn)生的無異常表型的無毛豬可能是其他皮膚病學(xué)的有效模型[33]；使用CRISPR/Cas9 靶向已知腫瘤抑制基因RUNX3，RUNX3 KO 豬可作為人類癌癥研究和開發(fā)的有用資源[34]等。雖然，一些疾病模型會表現(xiàn)出一些副作用，但可為人類疾病研究建立有價值的模型提供參考。

2.4 CRISPR/Cas9 在異種器官移植上的研究 盡管豬被認(rèn)為是人體異種器官移植的首選動物，但由于免疫排斥和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERVs）使得豬的器官移植成為障礙。

導(dǎo)致宿主對豬器官發(fā)生超急性排斥反應(yīng)的表面抗原主要包括由α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GGTA1）、胞苷單磷酸 N-乙酰神經(jīng)酸羥化酶（CMAH）、異紅細(xì)胞糖苷酯合成酶（i Gb3S）基因以及β4GALNT2基因等。為克服豬與人之間的生物學(xué)不相容，其中一種做法是去除豬細(xì)胞和組織上存在的主要抗原，如Gal、Neu5Gc 和 Sd（a）。Gao 等[35]采用CRISPR/Cas9 和HMC 技術(shù)產(chǎn)生了GGTA1/CMAH雙敲除（DKO）豬，在異種移植中表現(xiàn)出體液排斥降低，證明GGTA1/CMAH DKO 細(xì)胞比GGTA1-KO細(xì)胞更有效地免受體液應(yīng)答。Martens 等[36]敲除豬胚胎內(nèi)GGTA1、CMAH和β4GALNT2后克隆出三基因敲除豬（TKO），發(fā)現(xiàn)人類血清對TKO 細(xì)胞的異種免疫抗性結(jié)合顯著減少。Wang 等[37]通過CRISPR/Cas9靶向產(chǎn)生3 個基因（GGTA1、CMAH和β4GalNT2）TKO，TKO 豬的抗原性顯著降低，并且豬組織中剩余的異種抗原可以通過基因靶向方法消除。

移植器官短缺是器官衰竭治療的主要障礙。盡管異種移植是減輕人類器官移植短缺的期望策略，但豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERVs）跨種傳播的風(fēng)險阻礙了該方法的臨床應(yīng)用。Yang 等[38]對豬腎細(xì)胞系（PK15）中所有62 個拷貝的PERVs pol基因進(jìn)行敲除，豬內(nèi)源性病毒傳遞給人的風(fēng)險下降到以前的 1/1 000 以下，其證明PERVs 可能被滅活用于異種移植臨床應(yīng)用。Niu 等[39]通過分析豬PFF基因組，利用 CRISPR/ Cas9使25 個PERVs 基因失活，通過SCNT 技術(shù)成功克隆誕生世界首批內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒滅活豬，其研究強(qiáng)調(diào)了PERV 滅活以防止跨物種病毒傳播的價值，并證明了以生產(chǎn)PERV 滅活動物解決臨床異種移植中的安全問題。Al-Shehabi 等[40]強(qiáng)調(diào)SAMHD1 是一種潛在的屏障，在異種器官移植過程中阻止豬移植到人類受體的PERV 傳 播，通 過SIVmac Vpx 或CRISPR/Cas9 敲 除SAMHD1，以允許PERV 逆轉(zhuǎn)錄。

另外，應(yīng)用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對相關(guān)基因進(jìn)行敲除為建立大動物體內(nèi)產(chǎn)生人類臟器的生成奠定基礎(chǔ)。Wu等[41]應(yīng)用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對豬胚胎中胰腺發(fā)育相關(guān)基因PDX1進(jìn)行敲除，為結(jié)合人類多能干細(xì)胞（hPSCs）移植建立大動物體內(nèi)再生人類胰腺的平臺奠定基礎(chǔ)。Wang 等[42]使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)結(jié)合SCNT 技術(shù)成功地生成了SIX1和SIX1/SIX4靶向豬胎兒，而腎臟缺陷的豬胎兒的產(chǎn)生為利用囊胚互補(bǔ)技術(shù)在豬體內(nèi)產(chǎn)生人類腎臟提供了一個平臺。

CRISPR/Cas9 能夠快速生成含有多個定制遺傳修飾的基因編輯豬，預(yù)期這些修飾對豬-人異種移植的功效和安全性具有積極影響。CRISPR/Cas9 將在推動異種移植到臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。

3 CRISPR/Cas9 潛在脫靶活性分析

雖然CRISPR/cas9 已證明其編輯效率，但該系統(tǒng)缺乏避免通過靶基因組引入不希望的突變的能力。事實(shí)上，當(dāng)CRISPR/cas9 系統(tǒng)不僅只切割基因組上的目標(biāo)區(qū)域時，它可能產(chǎn)生無法預(yù)見的脫靶編輯，這可能會造成潛在的有害影響[43]。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對豬進(jìn)行基因編輯的相關(guān)研究分析了其脫靶效率。Whitworth 等[17]研究顯示，較高濃度的CRISPRs 可以提高體細(xì)胞的靶向效率，但結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)差異；王少華等[18]經(jīng)鑒定獲得了編輯CD163基因的細(xì)胞克隆點(diǎn)，其陽性率為90%；Huang 等[32]成功擴(kuò)增出28 個潛在脫靶位點(diǎn)（OTs），其中2 個位點(diǎn)的OTs 周圍有重疊峰；Yang 等[38]研究表明，連續(xù)誘導(dǎo)Cas9 會使PERVs 的靶向頻率增加，且在17 d 觀察到最大靶向頻率為37%；Wu 等[41]使用的雙sgRNA 指導(dǎo)的Cas9 核酸酶產(chǎn)生59% 的突變胚泡，提示Cas9 和雙重sgRNA 的組合是豬胚胎基因敲除和大DNA 片段突變篩選缺失的有力平臺；Carey 等[44]通過將CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接注射到發(fā)育中的胚胎中，脫靶的發(fā)生率很低，但這些事件無法準(zhǔn)確預(yù)測，每個CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的脫靶頻率應(yīng)在其應(yīng)用于臨床之前進(jìn)行有意識的評估。

另外，在對小鼠的研究中，Iyer 等[45]引入了毛色酪氨酸酶（Tyr）基因座的突變，還發(fā)現(xiàn)了幾種不期望的脫靶突變。Anderson 等[46]將來自小鼠和大鼠基因組的81 個基因組編輯項目的深度測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明在1 423 個預(yù)測的脫靶位點(diǎn)，其中32 個被證實(shí)，并且表明高保真Cas9 版本降低了體內(nèi)的脫靶突變率。Aryal 等[47]在來自200 個注射受精卵的38 只小鼠中，觀察到40%（15/38）的目標(biāo)效率通過NHEJ；5%的小鼠（2/38）通過HDR 引入預(yù)期突變。

總體而言，目前可用的CRISPR/cas9 應(yīng)用存在脫靶效應(yīng)時仍然存在高度可變性，表明仍不能基于該基因組編輯系統(tǒng)對所有實(shí)驗進(jìn)行穩(wěn)健預(yù)測[48]。如果具有挑戰(zhàn)性的不良影響得到解決，采用CRISPR/cas9 系統(tǒng)進(jìn)行的基因組編輯技術(shù)可更好地用于研究和臨床[43]。

4 小 結(jié)

自2013 年起，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被改造為基因編輯工具，其設(shè)計簡單、特異性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)使其在一些領(lǐng)域得到廣泛引用，但是CRISPR/Cas9 潛在的脫靶活性在一定程度上限制了其應(yīng)用。而隨著CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的不斷改進(jìn)和優(yōu)化以及新的Cas 系統(tǒng)（如eSpCas9、Hypa Cas9、HeFSpCas9s 等）出現(xiàn)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的缺點(diǎn)被不斷完善。另外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與其他技術(shù)的結(jié)合使得效率提高，成本降低，應(yīng)用范圍也將更加廣泛。近年來，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在豬遺傳改良、抗病育種、構(gòu)建人類疾病模型及異種器官移植等方面的研究逐漸改善，雖然建立了一些動物模型，但還是會出現(xiàn)一些副作用，產(chǎn)生的基因編輯豬還需后續(xù)觀察其基因編輯效果。