激光共聚焦技術(shù)在評(píng)定飼料酶制劑效果中的應(yīng)用

孟瑩瑩，楊懷榮，馬艷艷，司彥培，周莉芬

（青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東青島 266111）

近年來(lái)，酶制劑因其在降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子、保證飼料品質(zhì)、改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)、提高養(yǎng)分利用率、優(yōu)化飼料配方等方面發(fā)揮作用[1-4]，飼用酶制劑在畜禽及水產(chǎn)飼料中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但同時(shí)也存在標(biāo)準(zhǔn)不一、產(chǎn)品良莠不齊等問(wèn)題，給使用者帶來(lái)諸多不便[5]。對(duì)于選購(gòu)者而言，其最大的困惑集中在如何比較不同企業(yè)的酶制劑、怎樣辨別優(yōu)良適用的酶制劑等問(wèn)題。目前評(píng)估飼料酶制劑方法有常規(guī)酶活檢測(cè)、酶制劑的基本特性、酶制劑的穩(wěn)定性、應(yīng)用效果試驗(yàn)等[6-8]，應(yīng)用效果的試驗(yàn)主要集中在酶解干物質(zhì)消失率以及還原糖的生成量指標(biāo)上，但該方法在評(píng)價(jià)產(chǎn)品效果上存在很大的誤區(qū)；非淀粉多糖酶的應(yīng)用主要體現(xiàn)在破壞植物細(xì)胞壁對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的包裹作用，而非對(duì)纖維素或半纖維素的完全降解[9-11]。本試驗(yàn)旨在研究激光共聚焦熒光定量技術(shù)與體外酶解技術(shù)相結(jié)合在評(píng)定飼料酶制劑在酶解原料上的效果，通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化反映包裹營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的非淀粉多糖降解情況，補(bǔ)充飼用酶制劑的評(píng)價(jià)體系。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 麩皮、豆粕、玉米、菜粕、小麥來(lái)源于青島龍慧飼料廠；木聚糖酶5 萬(wàn)U/g、甘露聚糖酶5 萬(wàn)U/g、纖維素酶1 000 U/g、β-葡聚糖酶5 萬(wàn)U/g 配置成復(fù)合酶，單酶來(lái)源于青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司；瓊脂粉、戊二醛、酒精、石蠟、熒光增白劑、羅丹明B 染液等其他試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器 1150H 徠卡石蠟包埋機(jī)，PM2245 徠卡手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)及ASP200S 徠卡組織脫水機(jī)，LSM710激光共聚焦顯微鏡，SHA-C 恒溫水浴搖床，仿生消化儀，AP-9925N 真空抽濾泵。

1.3 體外酶解試驗(yàn)方法 ①分別稱取2.000 0 g 樣品麩皮、豆粕、玉米、菜粕、小麥，放人100 mL 三角瓶?jī)?nèi)，加入非淀粉多糖酶（NSP 酶）復(fù)合酶（木聚糖酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶）1 mg/g。加入10 mL pH 5.26 的PBS 溶液（磷酸鹽緩沖液：檸檬酸-Na2HPO4），加入約0.24 mL（1 mol/L）稀鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH 到5.26。將調(diào)整好pH 的樣品合均勻后，封口膜封口，放入41℃的恒溫水浴鍋內(nèi)，開(kāi)啟水浴鍋振蕩器，不斷振蕩（120 r/ min）。放入5 min 后開(kāi)始計(jì)時(shí)，繼續(xù)消化1 h。②取出三角瓶，小心取下封口膜，加入10 mL pH 為2.7 的稀鹽酸溶液，加入約2.2 mL（1 mol/L）鹽酸溶液將①中樣品pH 調(diào)到3.18，封口，混勻后繼續(xù)放入41℃恒溫水浴120 r/min，5 min 后開(kāi)始計(jì)時(shí)，消化60 min。③取出三角瓶小心取下封口膜。加入30 mL pH 為6.8 的磷酸鹽緩沖液（檸檬酸-Na2HPO4），加入10 mol/L 氫氧化鈉溶液約0.30 mL，使樣品pH 調(diào)至7.0（6.8～6.9）。將三角瓶放入41℃恒溫水浴鍋內(nèi)120 次/min，5 min 后開(kāi)始計(jì)時(shí)，消化240 min。④消化之后，將三角瓶中消化好的樣品進(jìn)行滅活處理，靜止備用。

1.4 飼料原料酶解染色激光共聚焦拍照 參考Nordlun等[12]的方法：①取材：將體外酶解的樣品包埋2% 的瓊脂塊（按2%～2.5% 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）中，選擇合適的粉體與瓊脂干物質(zhì)的比例，將瓊脂塊浸泡在2.5%（v:v）的戊醛溶液中固定24 h 以上。將組織從固定液取出在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。②脫水：將脫水盒放進(jìn)吊籃里于脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水。75% 酒精4 h，85% 酒精2 h，90% 酒精2 h，95% 酒精1 h，無(wú)水乙醇I 30 min，無(wú)水乙醇II 30 min，醇苯5～10 min，二甲苯I 5～10 min，二甲苯II 5～10 min，蠟I 1 h，蠟II 1 h，蠟III 1 h。③包埋：將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。于-20℃凍臺(tái)冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。④切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片，厚4 μm。切片漂浮于攤片機(jī)40℃溫水上將組織展平，載玻片將組織撈起，60℃烘箱內(nèi)烤片。水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩＂菝撓灒河枚妆矫撓?，再逐?jí)經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。⑥染色：0.01%的熒光增白劑和羅丹明B 染液分別染色10 min 后，洗凈染色液。⑦封片：用甘油明膠封片。⑧進(jìn)行激光共聚焦觀測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析均用SigmaPlot 12.5 統(tǒng)計(jì)軟件完成，數(shù)據(jù)間的比較采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05和P＜0.01 分別為差異顯著性和差異極顯著性標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，

2 結(jié)果

2.1 NSP 復(fù)合酶對(duì)玉米原料的體外酶解效果 由圖1-A可見(jiàn)，對(duì)照組玉米單層細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，蛋白質(zhì)仍被包裹在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中；但在NSP 酶處理組中細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重，細(xì)胞壁斷裂，而經(jīng)NSP 酶處理后玉米原料中的蛋白質(zhì)部分被釋放出來(lái)。由細(xì)胞壁的藍(lán)色熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析（圖1-B）發(fā)現(xiàn)，NSP 酶處理組熒光強(qiáng)度極顯著低于對(duì)照組。可見(jiàn)，NSP 酶能較好地破壞玉米細(xì)胞壁，解除植物細(xì)胞壁對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的包裹作用。

圖1 NSP 復(fù)合酶對(duì)玉米原料的體外酶解效果

2.2 NSP 復(fù)合酶對(duì)麩皮原料的體外酶解效果 由圖2 可見(jiàn)，對(duì)照組麩皮的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)熒光強(qiáng)度較NSP 酶處理組更強(qiáng)（P＜0.01）。小麥麩皮的細(xì)胞壁的最開(kāi)始從亞糊粉層開(kāi)始降解，其次水解糊粉層細(xì)胞壁胚乳層。

圖2 NSP 復(fù)合酶對(duì)麩皮原料的體外酶解效果

2.3 NSP 復(fù)合酶對(duì)豆粕原料的體外酶解效果 從圖3 可以看出，對(duì)照組仍有大量的條狀藍(lán)色熒光，豆粕中仍有很多豆皮沒(méi)有消化；經(jīng)過(guò)NSP 酶處理組的豆粕已經(jīng)沒(méi)有條狀藍(lán)色熒光；且NSP 酶處理組的藍(lán)色熒光強(qiáng)度極顯著降低。

圖3 NSP 復(fù)合酶對(duì)豆粕原料體外酶解結(jié)果

2.4 NSP 復(fù)合酶對(duì)菜粕原料的體外酶解效果 由圖4-A可見(jiàn)，對(duì)照組菜粕單層細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，蛋白質(zhì)仍被包裹在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中；但在NSP 酶處理組中細(xì)胞壁的破壞嚴(yán)重，細(xì)胞壁斷裂，包裹在其中的蛋白質(zhì)部分被釋放出來(lái)。由圖4-B 可以發(fā)現(xiàn)，組合NSP 酶熒光強(qiáng)度極顯著低于對(duì)照組。

圖4 NSP 復(fù)合酶對(duì)菜粕原料的體外酶解效果

3 討 論

體外酶解法是指將酶制劑與飼料預(yù)混后，模擬動(dòng)物胃和小腸內(nèi)消化環(huán)境，包括腸道溫度、酶液、pH 等[13]，測(cè)定干物質(zhì)以及還原糖的生成量。與傳統(tǒng)體外消化法相比，單胃動(dòng)物仿生消化儀更接近體內(nèi)消化環(huán)境，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)體外條件下簡(jiǎn)單模擬動(dòng)物胃腸道消化飼料的過(guò)程[14]，用于測(cè)定干物質(zhì)及能值的變化。這2 種常用的評(píng)價(jià)酶制劑應(yīng)用效果的方法都是間接地通過(guò)測(cè)定降解指標(biāo)的變化反映酶制劑的優(yōu)劣。李敬等[15]通過(guò)比較木聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶的降解產(chǎn)物和動(dòng)物機(jī)體的消化吸收得出僅利用還原糖生成量來(lái)評(píng)價(jià)酶制劑在動(dòng)物生長(zhǎng)中的作用效果并沒(méi)有實(shí)際意義，因?yàn)镹SP 酶的應(yīng)用主要體現(xiàn)在破壞植物細(xì)胞壁對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的包裹作用，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，生成低聚寡糖，改善腸道微生物菌群等，而非對(duì)纖維素或半纖維素的完全降解。低聚寡糖作為一種益生元，具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的作用，能夠促進(jìn)有益微生物的繁殖，維護(hù)動(dòng)物腸道健康[9]。李敬等[15]也認(rèn)為，降解的還原糖含量不能代表酶制劑發(fā)揮的效果。

Nordlund 等[12]通過(guò)使用激光共聚焦觀察組織結(jié)構(gòu)變化，研究酶和酵母培養(yǎng)物對(duì)麩皮發(fā)酵性和消化率的影響。崔晨曉[16]在麩皮的發(fā)酵改性及其在饅頭中的應(yīng)用研究中，同樣使用了激光共聚焦技術(shù)觀察小麥麩皮中的微觀結(jié)構(gòu)圖，通過(guò)酶制劑對(duì)小麥麩皮結(jié)構(gòu)的影響變化判定酶制劑在發(fā)酵麩皮中的效果。這種彌補(bǔ)了完全依靠生成還原的變化量來(lái)評(píng)價(jià)酶制劑優(yōu)劣的缺陷。王學(xué)東[17]使用激光共聚焦技術(shù)研究新型酶制劑改良小麥粉烘焙品質(zhì)的機(jī)理及其應(yīng)用研究；任江[18]用該技術(shù)研究棉纖維表面油漬洗滌機(jī)理。綜上，采用激光共聚焦技術(shù)研究原料的分子結(jié)構(gòu)的變化主要集中應(yīng)用在食品行業(yè)中，該方法通過(guò)研究原料結(jié)構(gòu)的變化反映酶制劑效果也得到行業(yè)的一致認(rèn)可。

但在酶制劑行業(yè)中，還沒(méi)有形成使用原料結(jié)構(gòu)的變化評(píng)定酶制劑的效果。本試驗(yàn)利用激光共聚焦技術(shù)，通過(guò)熒光染色對(duì)原料酶解前后β-葡聚糖和蛋白的染色標(biāo)記，觀察結(jié)構(gòu)的變化和熒光強(qiáng)度的定量檢測(cè)，最終反映酶制劑對(duì)于原料結(jié)構(gòu)的降解效果和暴露可消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。通過(guò)小麥的染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶首先作用于糊粉層和珠心表層的不溶性戊聚糖，將其轉(zhuǎn)化為可溶性戊聚糖，最后作用于最外層的戊聚糖，因此最外層的戊聚糖可以抵擋酶的作用[19]，亞糊粉層和胚乳細(xì)胞壁比糊粉層細(xì)胞壁更薄些，更易被酶水解。糊粉層細(xì)胞壁含有大部分的戊聚糖和β-葡聚糖，小麥麩皮則含有木質(zhì)素、纖維素和大量的戊聚糖[20]，多種酶的協(xié)同作用能更好地降解細(xì)胞壁和麩皮結(jié)構(gòu)，解除植物細(xì)胞壁對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的包裹作用。豆皮中纖維含量高[21]，本研究中在對(duì)照組可以看到很多藍(lán)色熒光條狀，酶處理組卻很少，表明大分子的纖維已被降解；菜粕中含有20% 左右的粗纖維[22]，酶處理后藍(lán)色熒光明顯減少。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)玉米、豆粕、麩皮以及菜粕飼料原料的激光共聚焦拍照，可以清晰地看到原料的結(jié)構(gòu)變化情況，對(duì)其進(jìn)行定性的直觀評(píng)價(jià)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的分析可以對(duì)酶制劑的優(yōu)劣進(jìn)行定量的分析。該方法評(píng)定酶制劑效果具有直觀效果，同時(shí)相比還原糖指標(biāo)分析更加科學(xué)。

4 結(jié) 論

激光共聚焦技術(shù)和體外酶解相結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化可更加直觀、有效、科學(xué)地評(píng)定酶制劑的應(yīng)用效果。