楊木纖維混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)還原糖

鄒 輝， 曾柏全*

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

全球嚴(yán)峻的能源形勢下促使各方努力地尋找新的清潔替代能源，木質(zhì)纖維素是自然界最廣泛及豐富的可再生生物能源[1-2]，其開發(fā)利用值得關(guān)注。楊樹是我國重要的速生用材樹種及主要的人工林樹種之一[3]，然而楊樹產(chǎn)業(yè)利用率低、能耗高、排污大、產(chǎn)品附加值不高等問題，限制了楊樹的資源利用。木質(zhì)纖維素中的纖維素成分很難直接被微生物利用轉(zhuǎn)化進(jìn)行生產(chǎn)[4]，要被微生物利用或轉(zhuǎn)化其它生物質(zhì)材料之前，必須要經(jīng)過一定方式的加工預(yù)處理。在各種預(yù)處理的方法中以稀酸處理的方式較為簡單和高效，稀酸處理大幅提高纖維素的酶水解速率，并能將幾乎全部的半纖維素去除，利用水解后的原料可進(jìn)行糖化發(fā)酵[5]。Karapatsia等[6]研究了球莖草蘆的稀酸預(yù)處理，當(dāng)生物質(zhì)顆粒在53～106 μm時(shí)，獲得最大的半纖維素轉(zhuǎn)化率（81.12%）和葡萄糖產(chǎn)率（93.24%）。Emmel等[7]在200～210℃下用0.087和0.175%（w/w）H2SO4浸漬處理桉樹2～5 min，在200℃時(shí)處理2 min通過酶解獲得纖維素轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到90%。對(duì)不同的材料水解預(yù)處理的條件也有所不同，影響稀酸水解效果的因素主要包括如固液比、材料的直徑、反應(yīng)溫度、水解時(shí)間以及酸的濃度等[5]。

自然界中纖維素的降解主要通過微生物產(chǎn)生的纖維素酶，其中真菌的降解能力較強(qiáng)，是降解木質(zhì)纖維素的重要來源之一，研究較多有木霉屬、青霉屬、曲霉屬等[8]。研究表明木霉菌和青霉菌是中國亞熱帶和熱帶森林中主要的纖維素分解菌[9]；而里氏木霉所生產(chǎn)纖維素酶系較完整，但β-葡萄糖苷酶酶活的不足限制了里氏木霉的使用。因此可以采用混菌發(fā)酵的方式來完善纖維素酶系，選擇具有協(xié)同作用的菌株可以使纖維素酶系得以互補(bǔ)提升酶含量從而提高酶解活性。因此本研究的目的在于通過單因素和響應(yīng)面相結(jié)合的試驗(yàn)方法進(jìn)行楊木纖維糖化處理的研究并以混合培養(yǎng)纖維素生產(chǎn)菌的方式提高纖維素酶的生產(chǎn)量酶解楊木纖維獲得生物可利用還原糖，以期降低木質(zhì)纖維素在后期應(yīng)用轉(zhuǎn)化為其它產(chǎn)物的生產(chǎn)成本。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

楊木，取自耐水速生型美國黑楊（由岳陽造紙廠供應(yīng)），自然風(fēng)干楊木粉碎成楊木屑（少于60目）。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

里氏木霉RutC-30、黑曲霉C112、斜臥青霉，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

種子培養(yǎng)基：土豆提取液200 g、葡萄糖20 g、酵母膏10 g（斜臥青霉添加蛋白胨5 g）、水1 000 mL、pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：楊樹預(yù)處理渣5 g、磷酸二氫鉀0.4 g、硫酸銨1.2 g、硫酸鎂0.1 g、氯化鈣0.05 g、蒸餾水100 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1楊木的成分測定

纖維素采用硝酸乙醇法測定，半纖維素采用二溴化法測定，木質(zhì)素采用Klason法測定[11]。

1.3.2種子液的制備

取1 mL含量為1.0×107/ mL孢子懸液接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，在29℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，得到種子液。

1.3.3楊木熱酸解液的制備及提取還原糖響應(yīng)面因素的確定

取10 g曬干粉碎并恒重的楊木屑于500 mL的錐形瓶中，加入一定體積及一定質(zhì)量的硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、純水，高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、0.1 MPa條件下水解，水解后冷卻至室溫，抽濾除去楊木渣，得楊木降解液取樣做還原糖提取率分析。在比較不同處理下選取稀硫酸進(jìn)一步研究液料比、硫酸濃度、處理時(shí)間對(duì)還原糖提取率的影響，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.4預(yù)處理?xiàng)钅驹陌l(fā)酵

分別將斜臥青霉、黑曲霉C112和里氏木霉RutC-30及不同比例的菌種接種到培養(yǎng)基中，進(jìn)行楊木纖維素發(fā)酵，以還原糖產(chǎn)量和纖維素酶活為指標(biāo)，比較不同情況下對(duì)楊木纖維的利用能力。

1.3.5楊木渣發(fā)酵液的酶解測定

將酸解處理的楊木渣，按照質(zhì)量比1∶10加入到經(jīng)酸水解發(fā)酵的液體中于50℃、120 r/min振蕩酶解，取酶解液過濾后5 000 r/min離心10 min，測還原糖提取率，并計(jì)算酶解得率。

1.4 分析方法

還原糖提取率及纖維素酶活力測定：

取發(fā)酵液于4℃、5 000 r/min條件下離心10 min，上清液即粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖提取率。按照參考文獻(xiàn)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y＝1.559 6 x－0.093 3，R2＝0.999。式中y為光密度（OD540），x為葡萄糖含量（mg/mL）。

羧甲基纖維素鈉酶（CMCase酶）活力：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入2 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.05 mol/L pH＝4.8）配置的1%的CMC-Na底物，50℃反應(yīng)30 min，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，于540 nm波長處測定樣品管中OD值，以滅活酶液作為對(duì)照。

濾紙酶活（FPAase）的測定：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入pH 4.8的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液2.0 mL，50℃反應(yīng)60 min，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，于540 nm波長處測定樣品管中OD值，以滅活酶液作為對(duì)照。

酶活定義為：在pH4.8、50℃的條件下，1 mL酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同預(yù)處理對(duì)楊木產(chǎn)還原糖的影響

表1為不同預(yù)處理方法楊木還原糖含量，結(jié)果表明，在不同預(yù)處理方法下稀硫酸處理?xiàng)l件下還原糖含量高于其它處理。與純水條件下相比，各處理都能提高水解液中還原糖的含量。氫氧化鈉預(yù)處理的主要功能是去除木質(zhì)素以及提高纖維底料的酶解可及度[12]，但氫氧化鈉的成本較高且處理后降解的半纖維素不能單糖的形式進(jìn)入水解液以致還原糖濃度過低。乙酸屬于弱酸、磷酸屬于中強(qiáng)酸、硫酸屬于強(qiáng)酸，一定強(qiáng)度的酸能更好的破壞木質(zhì)纖維的結(jié)構(gòu)，提高水解液中還原糖濃度，所以選用硫酸作為楊木的預(yù)處理方法。

表1 不同預(yù)處理方法楊木還原糖含量

2.2 楊木經(jīng)處理前后的組分變化

將楊木屑經(jīng)稀酸預(yù)處理后，得到的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量有所不同，其成分的變化如表 2所示。

表2 楊木屑經(jīng)預(yù)處理后的組分變化（以干重計(jì)算）

從表2 的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，預(yù)處理的強(qiáng)度是影響木質(zhì)纖維素固形物回收率的重要因素[13]。楊木屑在經(jīng)過稀酸的預(yù)處理后，半纖維素的分散不穩(wěn)定性決定半纖維素被大量降解，而纖維素和木質(zhì)素相對(duì)穩(wěn)定則被降解保留在固體物料中。此外，在處理的過程木質(zhì)素的含量不降反升的原因是在熱過程中有少量部分的碳水化合物轉(zhuǎn)化成為了假木素[14]。在稀酸的處理下纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞，半纖維素降解明顯，稀酸處理后所得的處理液中含有大量的可以用于微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化的糖類，最后通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)為各種生物基制品[15]。

2.3 硫酸水解預(yù)處理提取還原糖試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)中，隨著液料比的增大，降解液中還原糖提取率表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，液料比在10∶1時(shí)還原糖提取率達(dá)到最大值，這是由于在液料比較小時(shí)楊木屑不能較好的與稀酸發(fā)生反應(yīng)，在液料比增大到一定程度時(shí)，還原糖提取率不再上升，且液料比過大時(shí)升溫所需的成本會(huì)加大。酸濃度過低時(shí)不利于破壞楊木的纖維結(jié)構(gòu)，酸濃度過高時(shí)降解液中聚糖類被分解[5]，加快戊糖類轉(zhuǎn)化為糠醛的速度，使得還原糖提取率降低[16]，取酸濃度為2%為最佳。還原糖提取率在水解時(shí)間大于30分鐘時(shí)急劇上升，在90分鐘處提取率為最高，又在大于120分鐘時(shí)急劇下降。這可能是在較短時(shí)間內(nèi)楊木屑不能很好的與稀酸發(fā)生反應(yīng)，而過長的時(shí)間水解液中的還原糖被破壞，并且生成的附產(chǎn)物隨之增多，不利于還原糖的綜合利用。

采用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)對(duì)影響還原糖提取率的三個(gè)因素A液料比、B酸濃度、C處理時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表3，各因素對(duì)還原糖提取率影響結(jié)果如表4所示，響應(yīng)面R表示還原糖提取率。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.4 硫酸水解預(yù)處理提取還原糖二次回歸擬合及方差分析

通過用Design expert 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各因素對(duì)R影響的回歸方程如式（2）所示。

為了找出各因素的顯著性以及相互作用，對(duì)回歸方程進(jìn)行了方差分析，結(jié)果如表5所示。

通過表5可知，回歸方程模型的p＜0.000 1，說明模型非常顯著，相關(guān)系數(shù)R2＝0.982 4，該模型能解釋98.24%的數(shù)據(jù)結(jié)果，Radj相關(guān)系數(shù)為95.97%，與相關(guān)系數(shù)差值較小，表明試驗(yàn)結(jié)果與方程的擬合性較好。B（酸濃度）因素 P＜0.05，C（處理時(shí)間）因素 P＜0.05，說明酸濃度處理時(shí)間對(duì)模型的貢獻(xiàn)較大，對(duì)還原糖提取率有顯著影響。A2和B2的P值都小于0.001，說明它們對(duì)模型的貢獻(xiàn)較大，交互項(xiàng)BC的P＜0.05，說明它們之間的相互作用對(duì)還原糖的含量也有影響。由F值可知，對(duì)還原糖提取率的影響排序?yàn)椋篊（處理時(shí)間）＞B（酸濃度）＞A（液料比）。

表 5 方差分析表

圖1～圖3是根據(jù)模型方程繪制的等高線圖和曲面圖，由圖可知，在處理時(shí)間保持一定時(shí)，酸濃度與液料比對(duì)還原糖的影響等高線幾乎呈圓形，表明酸濃度與液料比交互作用極弱。響應(yīng)面坡度明顯，說明酸濃度與液料比對(duì)還原糖的影響較大，且在范圍內(nèi)有極大值。液料比與處理時(shí)間作用的等高線成橢圓形，說明它們之間的作用顯著。酸濃度與處理時(shí)間的等高線也成橢圓形，同樣說明酸濃度與處理時(shí)間作用顯著，且橢圓圓心在圖5等高線圖的上方，說明還原糖的最大值出現(xiàn)在處理時(shí)間相對(duì)較長的位置。

利用Design expert軟件由回歸方程計(jì)算分析，得到還原糖提取率在液料比為10.03∶1、酸濃度為2.03、處理時(shí)間103 min時(shí)達(dá)到最佳值為19.20%。為了驗(yàn)證回歸曲線的準(zhǔn)確性，實(shí)測三次，結(jié)果顯示得到還原糖提取率分別為19.40%、19.31%、19.24%，平均值為19.31%。與預(yù)測值基本一致，說明優(yōu)化后酸水解楊木產(chǎn)還原的條件是可靠的。

圖1 還原糖提取率與液料比、酸濃度的響應(yīng)面及等高線圖

圖2 還原糖提取率與液料比、處理時(shí)間的響應(yīng)面及等高線圖

圖3 還原糖提取率與酸濃度、處理時(shí)間的響應(yīng)面及等高線圖

2.5 預(yù)處理?xiàng)钅拘荚陌l(fā)酵實(shí)驗(yàn)

預(yù)處理?xiàng)钅拘紗尉N發(fā)酵的纖維素酶活如圖4所示，從圖4可知，楊木屑單菌種發(fā)酵在相同的條件下，黑曲霉能夠較好的利用楊木屑進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生較高的CMCase酶活，達(dá)到6.18 U/mL，里氏木霉的FPA酶活較高，達(dá)到2.04 U/mL，這與蘇存生等[17]利用里氏木霉在熱水預(yù)處理稻草優(yōu)化條件的培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果相近，其纖維素酶FPA、CMCase分別為3.67 U/mL和8.65 U/mL。黑曲酶具有較高的β-葡萄糖苷酶與CMCase酶活，但普遍的FPA酶活不是很高，相反的是里氏木霉具有較高的FPA酶活。

楊木屑混菌發(fā)酵的纖維素酶活如圖5～圖7所示。

圖4 單菌種發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶活

圖5 斜臥青霉和黑曲霉協(xié)同發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶活

圖6 黑曲霉和里氏木霉協(xié)同發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶活

圖7 斜臥青霉和里氏木霉協(xié)同發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶活

從圖5可知，雖然斜臥青霉與黑曲霉的混合培養(yǎng)所產(chǎn)生的FPA酶活不及純培養(yǎng)狀態(tài)下的斜臥青霉，但CMCase酶活較純培養(yǎng)的斜臥青霉提升約10%。

從圖6知，在黑曲霉與里氏木霉的比例為2∶8時(shí)，協(xié)同發(fā)酵所產(chǎn)生的酶活達(dá)到最佳值，纖維素酶FPA、CMCase分別為2.20 U/mL和6.95 U/mL，較單菌發(fā)酵的里氏木霉FPA酶活提升10%。在宋娜娜等[18]研究中里氏木霉與黑曲霉的以玉米秸稈為底物的混菌發(fā)酵中較里氏木霉單一培養(yǎng)的酶活提升50%，混菌發(fā)酵過程中低比例的里氏木霉不適于纖維素酶的生產(chǎn)合成，在黑曲霉與里氏木霉的比例為1∶9時(shí)，F(xiàn)PA酶活達(dá)到最低，CMCase酶活也相對(duì)較低。

從圖7知，斜臥青霉與里氏木霉在比例為3∶7時(shí)的纖維素酶活高于其它菌種組合協(xié)同發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶活，CMCase酶活和FPA酶活分別為7.24 U/mL、2.35 U/mL，相比與純培養(yǎng)條件下里氏木霉CMCase酶活提高1.7倍，而相比于純培養(yǎng)的黑曲霉FPA酶活，混合培養(yǎng)時(shí)酶活提高了5.2倍。說明里氏木霉與斜臥青霉的相互作用能有效的完善纖維素酶系組成。

2.6 酶解楊木渣的酶解得率測定

纖維素生產(chǎn)菌的混合培養(yǎng)能促進(jìn)菌株產(chǎn)酶、有效的完善纖維素酶系組成。試驗(yàn)通過比較單菌株產(chǎn)酶與混合菌株培養(yǎng)纖維素酶對(duì)楊木屑的協(xié)同作用。利用產(chǎn)酶條件下最優(yōu)秀的菌株比例按比例與楊木渣混合進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同菌株及不同混合比例對(duì)酶解得率的影響

由圖8可見，纖維素酶生產(chǎn)菌的混合培養(yǎng)對(duì)楊木渣的酶解效果有較大的影響，黑曲霉由于FPA酶活較低，酶解效果差，而里氏木霉FPA酶活相對(duì)較高則酶解相對(duì)較好，說明在酶解得過程中FPA酶活占較大作用。當(dāng)斜臥青霉和里氏木霉按3∶7混合培養(yǎng)時(shí)，對(duì)楊木渣的酶解得率達(dá)到21.7%?；旌吓囵B(yǎng)的纖維素生產(chǎn)菌對(duì)楊木渣酶解效果優(yōu)于純培養(yǎng)的纖維素酶生產(chǎn)菌，可能是由于纖維素菌株間的相互作用促進(jìn)了纖維素的降解，可見混合培養(yǎng)具有較大的優(yōu)勢。

3 結(jié)論

對(duì)楊木屑水解生產(chǎn)還原糖過程的預(yù)處理方式進(jìn)行優(yōu)化，并在優(yōu)化的基礎(chǔ)上選用產(chǎn)纖維素酶真菌酶解楊木渣產(chǎn)還原糖，得到以下的研究結(jié)果。

1）楊木中的半纖維素占比大且利用簡單，但木質(zhì)素的含量高限制了楊木的綜合利用，實(shí)現(xiàn)楊木發(fā)酵產(chǎn)能需要合理的預(yù)處理技術(shù)作為支撐。楊木中含纖維素44.2%、半纖維32.3%和木質(zhì)素19.8%，具有來源廣泛、成本低廉等優(yōu)勢，是良好的生物質(zhì)原料。

2）通過硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、純水的不同方法的預(yù)處理發(fā)現(xiàn)在稀硫酸下楊木水解液中還原糖含量最高。以稀硫酸作為預(yù)處理的方法，試驗(yàn)對(duì)液料比、酸濃度、處理時(shí)間3個(gè)因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)，以還原糖提取率為指標(biāo)值，采用響應(yīng)面分析法確定降解的最優(yōu)工藝參數(shù)，酸預(yù)處理過程最優(yōu)化條件為，液料比10.03、酸濃度2.03%、水解時(shí)間103 min，還原糖提取率平均值為19.31%。楊木水解液中還原糖含量豐富，能為后續(xù)的微生物利用提供碳源基礎(chǔ)。

3）通過三株高產(chǎn)纖維素酶菌株斜臥青霉、黑曲霉C112和里氏木霉RutC-30不同比例的菌種組合比例進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵，獲得能大幅度提升纖維素酶活的菌種比例為斜臥青霉和里氏木霉，接種比例為3∶7，酶解得率為21.7%。較純培養(yǎng)菌相比，酶解得率提升3.61倍。