二維核磁譜對木質(zhì)素酚與磨木木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的對照解析

張浩楠， 趙 瑾， 徐棟梁， 任 浩*

（南京林業(yè)大學(xué) 輕工與食品學(xué)院 江蘇省制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

木質(zhì)素是自然界中僅次于纖維素的第二大生物質(zhì)原料組成，其分子內(nèi)部含有大量無定形的由氧代苯丙醇及其衍生物構(gòu)成的聚合體，占植物細(xì)胞壁成分總量的 20%～30%[1]。在植物生長發(fā)育過程中，木質(zhì)素不僅提供植物組織機(jī)械支撐，保護(hù)細(xì)胞壁免受生物降解，而且能夠促進(jìn)植物中的水分傳輸[2]。在生物質(zhì)煉制及其相關(guān)行業(yè)，木質(zhì)素每年以1億噸左右的數(shù)量大量產(chǎn)生，并多以殘渣的形式處理和使用，其作為芳香族高分子化合物的功能特性并沒有得以廣泛挖掘[3-4]。

木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁全組分分離的主要屏障，木質(zhì)素的有效解構(gòu)與解離將會大幅提高生物質(zhì)煉制的總效率[5-6]。經(jīng)過大量的基礎(chǔ)研究，雖然木質(zhì)素的先驅(qū)體物質(zhì)、生物合成過程以及結(jié)構(gòu)單元之間的連接方式[7]已經(jīng)明確，但對于不同原料而言，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確信息受分離方法的影響極大[2,8]。本文分別選用針葉材中的馬尾松和闊葉材中的楊木為原料，采用相分離法高得率得到木質(zhì)素誘導(dǎo)體——木質(zhì)素酚（LPS），將其結(jié)構(gòu)特征通過二維核磁譜、凝膠色譜、紅外光譜等與自制的經(jīng)過短時間球磨和有機(jī)溶劑抽提的磨木木質(zhì)素（MWL）進(jìn)行了詳細(xì)比較分析。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

楊木、馬尾松 60目脫脂木粉；對甲酚、溴化鉀、氘代吡啶、氘代氯仿，購自上海麥克林生化科技有限公司；硫酸、丙酮、乙醚、1,4-二氧六環(huán)、氫氧化鈉、五氧化二磷、吡啶、乙酸、二氯乙烷、苯、乙醇、四氫呋喃，均購自南京化學(xué)試劑有限公司；聚苯乙烯標(biāo)樣購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 相分離法制備木質(zhì)素對甲酚

稱取1 g（精確到0.000 1）木粉原料于小燒杯中，加入10 mL對甲酚，充分浸潤5 min后加入20 mL72%濃硫酸，迅速用力攪拌5 min完成細(xì)胞壁的潤脹后，把小燒杯放到磁力攪拌器上反應(yīng)，反應(yīng)總時間控制在1 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到離心管中，在 3 500 r/min、25℃下離心 10 min，上層有機(jī)相經(jīng)過乙醚-丙酮-乙醚精制后，得到木質(zhì)素酚（LPS）產(chǎn)品。將LPS在40℃、P2O5存在下真空干燥24 h后，稱重計算得率。

1.3 磨木木質(zhì)素（MWL）的制備

苯醇抽提后的脫脂木粉采用微型行星式高能球磨機(jī)累計球磨3小時后，經(jīng)96%二氧六環(huán)抽提三次，合并抽提液經(jīng)濃縮蒸發(fā)揮發(fā)溶劑后得到粗木質(zhì)素。粗木質(zhì)素經(jīng)90%乙酸、二氯乙烷/乙醇（2∶1）、乙醚精制后回收不溶物得到磨木木質(zhì)素（MWL）[9]。這里的磨木木質(zhì)素由于球磨時間短，所以和傳統(tǒng)的 Bjorkman MWL在分子量和得率上均有差別。

1.4 木質(zhì)素樣品結(jié)構(gòu)表征

1.4.1紅外光譜（FT-IR）

將充分干燥的MWL、LPS樣品，分別與KBr固體以0.5/100～1/100的比例混合，壓片法制備待測樣品。在純KBr為背景，待測樣品在Bruker VERTEX80V 型紅外分析儀進(jìn)行紅外光譜分析，分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍4000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32次[10]。

1.4.2凝膠色譜（GPC）

將楊木和馬尾松的MWL、LPS樣品分別溶解在四氫呋喃溶液中，經(jīng)過孔徑為0.22 μm的有機(jī)針筒過濾器過濾，采用島津（Shimadzu）的高效凝膠滲透色譜儀測定木質(zhì)素的分子量，色譜柱型號分別為KF-804、KF-803、KF-802和KF-801，由 Asahipak 提供，柱子尺寸為8 mm ID×300 mm。檢測器為 SPD-20A，LC-20AB 型高壓液相泵，采用聚苯乙烯標(biāo)樣，流動相為四氫呋喃，進(jìn)樣量25 μL，流速1 mL/min，柱溫40℃。

1.4.3二維核磁（2D-HSQC NMR）測定

將楊木和馬尾松的MWL和LPS樣品充分真空干燥后，將樣品以70 mg/0.7 mL氘代DMSO-d6的比例混合均勻，經(jīng)棉過濾轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)核磁共振管中[11]，運(yùn)用Bruker Biospin公司的Bruker AVANCEIII 600 核磁共振儀進(jìn)行檢測。25℃條件下采樣，1H及13C兩維度的譜寬分別為9615 Hz和24900 Hz。1H維度的采樣點(diǎn)數(shù)為2048，弛豫時間為1.5 s，累加64次。13C維度的采樣點(diǎn)數(shù)為256。碳?xì)漶詈铣?shù)為145 Hz。在傅里葉變換前進(jìn)行沖零處理。利用所得2D-HSQC NMR譜圖[12-13]對MWL和LPS進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 楊木、馬尾松的MWL及其LPS得率

楊木、馬尾松的MWL及其LPS得率如表1所示。從表1可以看出，楊木及馬尾松MWL相對絕干木粉的得率分別為2.2%、2.1%，相對Klason木素的得率分別為13.6%、8.9%，而LPS相對木粉的得率分別為18.7%、24.9%，相對Klason木素的得率分別為107.1%、97.1%。對比兩種原料的LPS和MWL的得率發(fā)現(xiàn)相分離法幾乎把木粉中的天然木質(zhì)素全部分離轉(zhuǎn)化成了LPS，而MWL得率極低，在研究木質(zhì)素所有結(jié)構(gòu)單元的組成及單元結(jié)構(gòu)之間連接的鍵型特征時LPS更具有代表性。

表1 楊木、馬尾松球磨木質(zhì)素及木質(zhì)素對甲酚得率

2.2 楊木及馬尾松MWL、LPS的紅外光譜（FT-IR）分析

楊木及馬尾松MWL、LPS的紅外譜圖如圖1所示。從木質(zhì)素的骨架結(jié)構(gòu)特征上看，無論是MWL還是LPS，在1650 cm-1、1500 cm-1、1460 cm-1處均呈現(xiàn)了木質(zhì)素苯環(huán)的骨架振動，在3450 cm-1處觀察到羥基的吸收峰，在1140 cm-1以及1040 cm-1處具有苯環(huán)醚鍵（甲氧基）的伸縮振動吸收峰；楊木和馬尾松在1270 cm-1處均可觀察到 G 型木質(zhì)素單元苯環(huán)骨架振動吸收峰，楊木在1325 cm-1處具有S型木質(zhì)素單元苯環(huán)呼吸振動吸收峰，說明馬尾松為G型木質(zhì)素而楊木為GS型木質(zhì)素[14]。對比MWL與LPS紅外譜圖可以發(fā)現(xiàn)，MWL在1700 cm-1處可見由LCC中的醛基引起的吸收峰，LPS在815 cm-1處可見由對甲酚導(dǎo)入苯環(huán)上鄰位氫原子變角振動引起吸收峰。

圖1 馬尾松及楊木木質(zhì)素紅外光譜

2.3 木質(zhì)素的分子量及其分布

對楊木和馬尾松的MWL、LPS進(jìn)行分子量測定[15]，其結(jié)果如表2所示，從表中對比可以發(fā)現(xiàn)，楊木LPS重均分子量3293 明顯大于楊木MWL的重均分子量1686，LPS的分散比1.13較MWL分散比1.71更接近于1；馬尾松LPS的重均分子量3819大于馬尾松MWL的重均分子量3122，馬尾松LPS的分散比（1.07）也更接近于1。以上結(jié)果說明LPS分子尺寸更為均一化，這是由于相分離過程中木質(zhì)素的芐基位置高頻度地導(dǎo)入了對甲酚，發(fā)生了有規(guī)則的大分子碎片化[16]，得到的均一化程度高的木質(zhì)素產(chǎn)品將有利于進(jìn)一步的應(yīng)用開發(fā)。

表2 楊木、馬尾松不同處理后樣品的分子量及其分散比

2.4 楊木及馬尾松由來的MWL和LPS的2D-HSQC NMR 譜圖解析

圖2 馬尾松及楊木MWL二維核磁譜圖

馬尾松及楊木MWL二維核磁譜圖側(cè)鏈區(qū)（δC/δH 50-90/2.5-6.0）和芳香環(huán)區(qū)（δC/δH 90-160/6.0-8.0）如圖2所示，其相關(guān)信號歸屬表如表3所示，參考Wen等[2]相對定量方法對各結(jié)構(gòu)單元積分計算結(jié)果如表4所示。馬尾松MWL在芳香環(huán)區(qū)具有愈創(chuàng)木基單元（G，93.15%）以及對羥基苯單元（H, 6.85%）相關(guān)信號，G/H比為13.60，說明馬尾松木質(zhì)素為G型木質(zhì)素；楊木MWL在芳香環(huán)區(qū)具有愈創(chuàng)木基單元（G, 32.64%），紫丁香基單元（S, 66.68%）以及對羥基苯單元（H, 0.69%）的相關(guān)信號，S/G比為2.04，表現(xiàn)出典型的闊葉材GS型木質(zhì)素的特征。觀察側(cè)鏈區(qū)觀察到馬尾松及楊木MWL具有大量的β-O-4醚鍵(A)結(jié)構(gòu)，可通過其α、β、γ位的相關(guān)信號進(jìn)行識別，馬尾松及楊木MWL β-O-4含量分別為62.84%、75.54%，同樣觀測到γ位乙?；?β-O-4醚鍵（A?）結(jié)構(gòu)，馬尾松及楊木其相應(yīng)的 γ位相關(guān)信號 δC/δH分別在 62.90/4.14和63.24/4.46；在圖譜中同時可識別到β-5（IC）結(jié)構(gòu)的α、β、γ位的相關(guān)信號，馬尾松及楊木MWL中β-5含量分別為26.17%、14.74%，馬尾松木質(zhì)素缺少S型單元，具有更多的G型單元，其芳香環(huán)5號位空間位阻更小，使其具有更多的β-5結(jié)構(gòu)；圖譜中同樣可以觀測到β-β樹脂醇（B）結(jié)構(gòu)的α、β、γ位的相關(guān)信號，也發(fā)現(xiàn)了另一種由于γ位乙?；纬搔?β四氫呋喃（B?）結(jié)構(gòu)，馬尾松及楊木其相應(yīng)的α位相關(guān)信號δC/δH分別在83.23/4.82和83.45/4.81，馬尾松及楊木MWL β-β含量分別為10.99%、9.72%；同時觀測到β-1螺旋二烯酮結(jié)構(gòu) α、β位的相關(guān)信號。此外，譜圖中可觀察到對羥基肉桂醇（F）、乙?；膶αu基肉桂醇（F?）、阿魏酸酯（FA）、對香豆酸酯（p CA）這些先體結(jié)構(gòu)的相關(guān)信號。

圖3 馬尾松及楊木LPS二維核磁譜圖

馬尾松及楊木LPS二維核磁譜圖脂肪區(qū)（δC/δH 18-25/1.8-2.5）、側(cè)鏈（δC/δH50-90/2.5-6.0）和芳香環(huán)區(qū)（δC/δH 90-160/6.0-8.0）如圖3所示，其相關(guān)信號歸屬表如表3所示，同上述MWL一樣，各結(jié)構(gòu)單元相對含量的積分計算結(jié)果如表4所示。馬尾松LPS同樣在芳香環(huán)區(qū)具有愈創(chuàng)木基單元（G, 93.83%）以及對羥基苯單元（H, 6.17%）相關(guān)信號，G/H比為15.21，與馬尾松MWL的G/H比13.60相比較，發(fā)現(xiàn)馬尾松LPS在結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成上未發(fā)生本質(zhì)的變化；楊木LPS在芳香環(huán)區(qū)具有愈創(chuàng)木基單元（G, 29.47%）、紫丁香基單元（S, 66.97%）以及對羥基苯單元（H, 3.56%）的相關(guān)信號，S/G比為2.27，與楊木MWL的G/H比2.04相比較，發(fā)現(xiàn)楊木LPS同樣在結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成上未發(fā)生顯著變化；兩者也均在側(cè)鏈區(qū)可觀測到β-O-4醚鍵（A）、γ位乙?；摩?O-4醚鍵（A?）、β-5（IC）、β-β樹脂醇（B）等基本鍵型結(jié)構(gòu)的相關(guān)信號，但由于對甲酚接枝到丙烷側(cè)鏈的α位上，除β-5（IC）由于空間位阻更大的原因，其他鍵型均觀測不到α位的相關(guān)信號，這是因?yàn)閷追訉?dǎo)入芐基位α位氫原子缺失造成的。其中馬尾松LPS中β-O-4、β-5、β-β含量分別為64.66%、9.30%、13.52%，楊木LPS中β-O-4、β-5、β-β含量分別為76.09%、10.39%、13.52%，對比發(fā)現(xiàn)LPS在鍵型的構(gòu)成上也基本保留了MWL鍵型的基本構(gòu)成；在LPS分子中也可觀測到對羥基肉桂醇(F)、乙酰化的對羥基肉桂醇（F?）、阿魏酸酯（FA）、對香豆酸酯（p CA）這些先體結(jié)構(gòu)的相關(guān)信號。對比MWL的二維譜圖及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，LPS保留了與原本木質(zhì)素最接近的MWL相似的結(jié)構(gòu)單元及鍵型構(gòu)成。從脂肪區(qū)圖譜可以看到歸屬于LPS的L2,6（δC/δH 129.7/7.10）和L3（δC/δH 108.3/6.72）、對甲酚單體 L?3,5（δC/δH 110.1/6.90）的甲基相關(guān)信號，并可以在側(cè)鏈區(qū)及苯環(huán)區(qū)找到芳香環(huán)上和側(cè)鏈上的相關(guān)信號，這些都證明通過相分離方法分離出來的木質(zhì)素，在保持了木質(zhì)素骨骼結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，成功引入了富含羥基的對甲酚接枝結(jié)構(gòu)。

表3 球磨木質(zhì)素及木質(zhì)素對甲酚的核磁共振歸屬表

（續(xù)表3）

表4 楊木、馬尾松MWL及LPS各單元及鍵型組成

圖4 木質(zhì)素樣品二維譜圖中脂肪區(qū)、側(cè)鏈區(qū)及芳香環(huán)區(qū)主要基本聯(lián)接結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)單元

3 結(jié)論

以楊木和馬尾松脫脂木粉為原料，對其進(jìn)行球磨和相分離處理后，得到的MWL和LPS產(chǎn)物通過得率和結(jié)構(gòu)解析，對比得出如下結(jié)論：

1）楊木和馬尾松兩種原料通過相分離法得到的分離木質(zhì)素LPS得率遠(yuǎn)高于MWL；2）紅外光譜分析表明兩種原料的LPS和MWL都具有相似的木質(zhì)素骨架結(jié)構(gòu)；

3）凝膠色譜分析數(shù)據(jù)表明LPS比相應(yīng)的MWL具有較高分子量和較均一的多分散性；

4）二維核磁譜表明LPS與相應(yīng)的MWL相比有近似的單元結(jié)構(gòu)組成及單元結(jié)構(gòu)之間的連接方式。此外，由于對甲酚的導(dǎo)入LPS的二維譜中增加了由于對甲酚引起的特征信號。

這些數(shù)據(jù)都說明通過相分離方法得到的分離木質(zhì)素LPS，不僅得率高、活性官能團(tuán)多、分子量的分布相對均一而且保持了最接近天然木質(zhì)素的木質(zhì)素骨架結(jié)構(gòu)特征。這些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)對于木質(zhì)素酚作為基礎(chǔ)芳香族工業(yè)原料的開發(fā)和利用具有重要意義。