叢毛單胞菌對鄰甲酚及對甲酚的降解特性*

張立志 余思彤 袁 欣 王 鈺 宋兆健 包永明 張旭旺

(大連理工大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221)

隨著工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，我國對煤炭資源的消耗日益嚴(yán)重，產(chǎn)生了大量含有油、酚、氨等污染物的工業(yè)廢水[1-3]。污水處理廠進(jìn)水中的酚類物質(zhì)可達(dá)300～800 mg/L[4]296。酚類廢水中，以苯酚和甲酚造成的污染最嚴(yán)重。其中，鄰甲酚和對甲酚同屬于甲酚同分異構(gòu)體，在日常生活中應(yīng)用廣泛。這兩種同分異構(gòu)體具有強(qiáng)烈的腐蝕性及毒性，被美國環(huán)境保護(hù)署列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物的黑名單，同時(shí)也是我國重點(diǎn)控制污染物之一[5]。

生物法因處理效率高、操作簡單、成本低廉而受到廣泛關(guān)注。BAYLY等[6]開展了利用假單胞菌(Pseudomonassp.)菌株突變體降解苯酚和甲酚的研究。RIHAM等[7]研究了固定在聚乙烯醇凝膠中的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)降解對甲酚的能力，結(jié)果表明，對甲酚為200 mg/L時(shí)降解效果最佳。ELENI等[8]發(fā)現(xiàn)，嗜堿菌小球藻(Advenella)LVX-4在對甲酚為750 mg/L的高濃度條件下也具有降解對甲酚的能力。目前，已有較多關(guān)于甲酚降解菌特性的研究，已報(bào)道菌株資源還包括蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)[9]、泛影桿菌(Diaphorobacter)[10]、農(nóng)桿菌(Citrobacterfarmeri)[11]等；關(guān)于叢毛單胞菌(Comamonassp.)對甲酚降解的研究較少，大多是對染料廢水、聚-β-羥丁酸(PHB)、氨氮、苯、苯酚及喹啉等污染物的去除[12-13]。甲酚好氧生物降解路徑主要有兩種：一種為龍膽酸途徑[14]531-532；另一種為兒茶酚途徑[15]373-376。兩者均需在雙加氧酶的作用下使苯環(huán)斷裂，進(jìn)而進(jìn)入下游代謝。

本課題組自大連某污水處理廠活性污泥中分離出一株可降解喹啉的Comamonassp. Z1(以下簡寫為Z1)，研究發(fā)現(xiàn)，Z1能降解鄰甲酚與對甲酚。因此，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察其對鄰甲酚和對甲酚的降解特性及路徑。本研究在豐富可降解甲酚生物資源的同時(shí)，也可為實(shí)際含酚廢水的生物處理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

Z1的16S rRNA基因序列的GenBank號為MF07332[16]。在100 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別加入一定濃度的鄰甲酚與對甲酚作為唯一碳源與能源，接種量占5%(體積分?jǐn)?shù))，在pH=7.0、30 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 3.28 g/L，KH2PO42 g/L，(NH4)2SO42 g/L，F(xiàn)eCl30.25 mg/L，pH=7.0。

1.3 主要試劑與儀器

鄰甲酚、對甲酚、丙酮、乙酸乙酯及各類金屬鹽等均為分析純，甲醇為色譜純。

紫外-可見分光光度計(jì)(UH5300，日本HITACHI公司)；高效液相色譜(HPLC)儀(LC-2030C 3D，日本島津公司)；四級桿軌道離子阱高分辨質(zhì)譜(MS)儀(Q Exactive，美國Thermo Fisher公司)。

1.4 生物降解實(shí)驗(yàn)

與微生物去除污染物這一過程密切相關(guān)的環(huán)境因素包括底物濃度、pH、金屬離子、溫度及溶氧量等。實(shí)驗(yàn)選擇對生物去除底物影響較大且考察較普遍的環(huán)境因素進(jìn)行研究，包括底物濃度、pH、金屬離子。在已有關(guān)于Comamonassp.的研究報(bào)道中，其在29～35 ℃培養(yǎng)時(shí)，PHB的降解效果最好[17]。固定化水生叢毛單胞菌(Comamonasaquatica)LNL3降解氨氮的最適溫度為30 ℃[18]。Comamonassp. JB降解苯、甲苯、二甲苯的實(shí)驗(yàn)，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)ZD4-1降解苯酚的實(shí)驗(yàn)均以30 ℃為最適培養(yǎng)條件[19-20]。文獻(xiàn)報(bào)道中以振蕩培養(yǎng)的方式提供生物降解活動中需要的氧。因此，本研究也選擇在30 ℃下振蕩培養(yǎng)。

未特別說明，實(shí)驗(yàn)條件一般為：在裝有25 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中分別加入50 mg/L鄰甲酚或100 mg/L對甲酚，不額外增加金屬離子，在接種量5%、pH=7.0、30 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣監(jiān)測Z1的生長情況及殘留的鄰甲酚或?qū)追訚舛取?/p>

(1) 底物濃度影響：分別加入25～125 mg/L鄰甲酚或25～300 mg/L對甲酚。

(2) pH影響：設(shè)置pH為5.0～9.0。

(3) 金屬離子影響：選擇環(huán)境中常見的金屬離子(Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Cd2+)，均以0.5 mmol/L加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。

1.5 分析方法

(1) 菌株生長情況以660 nm下的吸光度表示，以紫外-可見分光光度計(jì)測定。鄰甲酚與對甲酚的殘留濃度采用HPLC分析，降解中間產(chǎn)物的鑒定采用HPLC/MS分析。

(2) HPLC分析：間隔一段時(shí)間，取反應(yīng)液加入適量乙酸乙酯，振蕩萃取10 min，取1.5 mL上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件：Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，流動相為水/甲醇。梯度洗脫：0～15 min，40%(體積分?jǐn)?shù)，下同)～80%甲醇；15～20 min，40%甲醇。

(3) HPLC/MS分析：選取菌株對數(shù)生長中期與末期，間隔一段時(shí)間，取反應(yīng)液加入適量乙酸乙酯，振蕩萃取10 min，取5 mL上清液，用氮吹至1 mL，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行HPLC/MS分析。HPLC條件：流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃。梯度洗脫：0～1.0 min，5%～95%甲醇；1.0～7.0 min，95%甲醇；7.0～7.1 min，5%甲醇；7.1～8.0 min，5%甲醇。MS條件：采用電噴霧離子源，霧化室溫度320 ℃，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣和干燥氣，進(jìn)行正、負(fù)模式掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對Z1降解鄰甲酚與對甲酚的影響

煤化工廢水中可能含有多種酚類化合物，且因其具有生物毒性而對微生物的生長及代謝產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)探究了不同質(zhì)量濃度鄰甲酚與對甲酚對Z1的生長及其降解的影響，結(jié)果見圖1。Z1可利用鄰甲酚與對甲酚作為唯一碳源進(jìn)行生長，36 h內(nèi)能將25～75 mg/L鄰甲酚、25～200 mg/L對甲酚完全降解。當(dāng)鄰甲酚為25～100 mg/L時(shí)，Z1最大生長量隨著質(zhì)量濃度的增大而提高。25 mg/L時(shí)Z1生長延滯期較短，其他濃度條件下延滯期均達(dá)12 h。隨鄰甲酚濃度的增大，Z1完全降解所需時(shí)間延長。25 mg/L時(shí)24 h可完全降解，125 mg/L時(shí)需48 h才能實(shí)現(xiàn)完全降解。與鄰甲酚相比，Z1對對甲酚的耐受性更高。Z1在對甲酚為25～200 mg/L時(shí)表現(xiàn)出良好的降解性能，均可在36 h內(nèi)完全降解。當(dāng)對甲酚提高到300 mg/L時(shí)，Z1的生長受到明顯抑制，但36 h內(nèi)仍可降解43.46%的對甲酚。從石化污水處理廠的活性污泥中分離出的鄰甲酚高效降解菌Pseudomonassp. JF2，可在20 h內(nèi)將600 mg/L鄰甲酚完全去除[21]266。在小球藻(Chlorellavulgaris)處理煤氣化廢水的研究中，其降解對甲酚的耐受質(zhì)量濃度高達(dá)400 mg/L[4]300。從石油煉制廢水中分離出的菌株芽孢桿菌(Bacillussp.)DBK4能在約2 d內(nèi)將500 mg/L對甲酚完全降解[22]3。與它們相比，Z1對鄰甲酚與對甲酚的耐受性相對偏低，但仍可作為酚類廢水處理的有效候選菌株。

圖1 Z1的生長及其對不同質(zhì)量濃度鄰甲酚與對甲酚的降解Fig.1 Growth of Z1 and degradation of o-cresol and p-cresol under different mass concentrations

2.2 pH對Z1降解鄰甲酚與對甲酚的影響

參與生化降解反應(yīng)的酶活易受環(huán)境pH影響。實(shí)驗(yàn)探究了不同pH對Z1生長及降解鄰甲酚與對甲酚的影響，結(jié)果見圖2。Z1以鄰甲酚為碳源，當(dāng)pH為5.0～8.0時(shí)，Z1生長延滯期較短(6 h)；當(dāng)pH為9.0時(shí)，Z1生長延滯期延長至30 h，且生長抑制明顯。當(dāng)pH為5.0、6.0時(shí)，Z1對鄰甲酚的降解周期延長；當(dāng)pH為7.0～9.0時(shí)，鄰甲酚降解相對較快，pH為8.0時(shí)Z1可在24 h內(nèi)將50 mg/L的鄰甲酚快速降解。Z1以對甲酚為碳源，當(dāng)pH為5.0時(shí)，Z1生長延滯期最長，可達(dá)12 h。當(dāng)pH為6.0～9.0時(shí)，Z1可在24 h內(nèi)將100 mg/L對甲酚降解完全；當(dāng)pH為5.0時(shí)，降解受到嚴(yán)重抑制，雖仍能在36 h內(nèi)完成降解，但降解周期相對較長。前期研究發(fā)現(xiàn)，印度膠質(zhì)瘤(Gliomastixindicus)MTCC 3869降解對甲酚的最適pH為6.0[23]，Bacillussp. DBK4降解對甲酚的最適pH為7.0[22]4，Pseudomonassp. JF2降解鄰甲酚的最適pH為7.0～8.0[21]267。與之相比，本研究中Z1則可在pH為8.0時(shí)，分別將50 mg/L鄰甲酚或100 mg/L對甲酚快速降解。

圖2 不同pH下Z1的生長及其對鄰甲酚與對甲酚的降解Fig.2 Growth of Z1 and degradation of o-cresol and p-cresol under different pH

2.3 金屬離子對Z1降解鄰甲酚與對甲酚的影響

廢水中通常會含有Cu2+、Ni2+、Cd2+等金屬離子，它們可能對微生物酶活性產(chǎn)生影響，從而影響微生物的生長及其生化降解過程[24]1035-1036。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，0.1～1.0 mmol/L不同金屬離子對菌株生物降解過程的影響較顯著[25-26]。已有關(guān)于不同金屬離子對Comamonassp.生物合成及酶活影響的研究，如Comamonassp. IDO2合成靛藍(lán)的特性研究中，考察0.5 mmol/L不同金屬離子對其合成靛藍(lán)的影響，結(jié)果表明，Ba2+和Ca2+對靛藍(lán)的合成有明顯的促進(jìn)作用，Mg2+幾乎無影響，而Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+的抑制效果最明顯[27]；Comamonassp. UVS胞內(nèi)藜蘆醇氧化酶的純化與表征及其在紡織染料脫色中的作用研究結(jié)果表明，該酶活被0.5 mmol/L的Cu2+、Zn2+、Hg2+和Cd2+分別抑制了85%、65%、48%、35%[28]。結(jié)合文獻(xiàn)，本研究選擇0.5 mmol/L作為實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)果如圖3所示。降解過程中，Co2+、Ni2+、Cu2+對Z1生長、底物降解抑制作用明顯，Zn2+、Mn2+、Cd2+也對Z1生長、底物降解有一定的抑制作用，而Mg2+對Z1生長、底物降解產(chǎn)生促進(jìn)作用。研究表明，Mg2+對許多生物過程具有顯著影響，并且在激活酶、調(diào)節(jié)代謝和穩(wěn)定核苷酸結(jié)構(gòu)方面具有不可或缺性[29]。Co2+、Ni2+、Cu2+等金屬離子的加入，使甲酚類降解周期延長，這可能與金屬離子能與酶的巰基結(jié)合使酶失活相關(guān)[24]1035-1036。

圖3 不同金屬離子對Z1生長及其對鄰甲酚與對甲酚降解的影響Fig.3 Growth of Z1 and the effect on the degradation of o-cresol and p-cresol by different metal ions

2.4 降解產(chǎn)物分析

利用HPLC/MS對Z1降解鄰甲酚的產(chǎn)物進(jìn)行分析，檢測到5種中間產(chǎn)物，分別為2-羥基苯甲醇(質(zhì)荷比(m/z)=123.045 15)、2-羥基苯甲醛(m/z=121.029 50)、2-羥基苯甲酸(m/z=137.024 42)、2-羥基-6-酮庚-2，4-二烯酸(m/z=155.034 98)和2-羰基-4-烯戊酸(m/z=114.032 24)。在AHAMAD等[15]373-376所開展的利用Pseudomonassp. CP4降解鄰甲酚的研究中，核磁共振氫譜分析也檢測出2-羥基-6-酮庚-2，4-二烯酸和2-羰基-4-烯戊酸這兩種中間產(chǎn)物。

對甲酚的降解過程中檢測到4種中間產(chǎn)物，分別為4-羥基苯甲醇(m/z=123.04 515)、4-羥基苯甲醛(m/z=121.029 50)、4-羥基苯甲酸(m/z=137.024 42)和龍膽酸(m/z=153.019 33)。這幾種中間產(chǎn)物在Bacillussp. PHN1降解對甲酚的過程中均被檢測到[14]531-532。

2.5 降解路徑分析

通常，鄰甲酚首先被氧化生成3-甲基兒茶酚或4-甲基間苯二酚，然后進(jìn)入兒茶酚降解途徑進(jìn)一步被降解[15]371-373。而微生物則可通過兩種途徑降解對甲酚：(1)通過與鄰甲酚降解類似的苯環(huán)羥化過程，形成4-甲基兒茶酚，然后經(jīng)兒茶酚途徑進(jìn)入下游代謝[30]；(2)首先攻擊甲基，然后甲基被氧化成羧基，生成龍膽酸，進(jìn)入龍膽酸降解途徑[31]4-5。

注：括號內(nèi)物質(zhì)表示實(shí)際未檢測到而推測的物質(zhì)。圖4 Z1對鄰甲酚與對甲酚的降解路徑推測Fig.4 Possible pathways for the degradation of o-cresol and p-cresol by Z1

根據(jù)HPLC/MS分析結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)推測Z1降解鄰甲酚可能存在兩種途徑(見圖4(a))：(1)鄰甲酚首先通過甲基位的羥化及羧化過程，依次被氧化為2-羥基苯甲醇、2-羥基苯甲醛及2-羥基苯甲酸(水楊酸)，因降解方式與已知降解模式類似，所以猜測隨后進(jìn)入龍膽酸降解途徑[31]4-5。(2)鄰甲酚首先被氧化生成3-甲基鄰苯二酚，隨后進(jìn)入兒茶酚降解途徑，即經(jīng)間位開環(huán)依次形成2-羥基-6-酮庚-2，4-二烯酸和2-羰基-4-烯戊酸，然后進(jìn)一步被降解，最終礦化。這一途徑與Pseudomonassp. CP4降解鄰甲酚的過程相同[15]373-376。因此，推斷Z1能利用龍膽酸與兒茶酚途徑降解鄰甲酚。

Z1降解對甲酚可能途徑(見圖4(b))：對甲酚首先被氧化生成4-羥基苯甲醇，而后經(jīng)脫氫、氧化形成4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、龍膽酸，最后進(jìn)入龍膽酸降解途徑。該路徑與Bacillussp. PHN1降解對甲酚的過程相同[14]531-532，所以Z1通過龍膽酸途徑降解對甲酚。

3 結(jié) 論

(1) Z1可利用鄰甲酚與對甲酚作為唯一碳源進(jìn)行生長，36 h內(nèi)能將25～75 mg /L鄰甲酚、25～200 mg/L對甲酚完全降解。

(2) Z1可在pH為8.0時(shí)將50 mg/L鄰甲酚或100 mg/L對甲酚快速降解。

(3) Mg2+對Z1生長、底物降解產(chǎn)生促進(jìn)作用，Co2+、Ni2+、Cu2+等金屬離子則具有抑制作用。

(4) 推斷Z1能利用龍膽酸與兒茶酚途徑降解鄰甲酚，通過龍膽酸途徑降解對甲酚。