泛素化特異性蛋白酶18在結直腸癌中的表達及其臨床意義

易禮智，程征宇，王 琴，徐 輝

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常見惡性腫瘤之一[1]，也是我國第四常見的惡性腫瘤，其引起的死亡率呈逐年增長的趨勢[2]。轉移和復發(fā)是CRC患者死亡的主要原因。盡管隨著科學技術的進步，近年來結直腸癌的臨床診斷和治療方法及藥物研究有了很大的進步，但CRC的長期生存率并未明顯提升[3]。因此，探討結直腸癌發(fā)生的分子機制仍具有重要的意義。泛素特異性蛋白酶18 (Ubiquitin-specific peptidase 18，USPl8)是干擾素激活基因15(interferon(IFN)-stimulated gene 15，ISG15)的一個特異性蛋白酶，同時也是與ISG15結合的一個至關重要的調節(jié)蛋白[4]。最近有研究[5-7]顯示，USP18的表達在一些腫瘤如膀胱癌、乙肝病毒相關的肝細胞癌等里面異常的異常升高可能與腫瘤的發(fā)生有關。本文研究USP18在結直腸癌中的表達及意義，期望能為臨床結直腸癌的治療提供新的靶點及治療策略。

1材料與方法

1.1材料 收集某人民醫(yī)院手術切除后經病理診斷為結直腸癌的石蠟組織標本114例，其中男性72例，女性42例；年齡26～76歲，平均年齡53.8歲。另外收集40對新鮮的結直腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織置于液氮中保存?zhèn)溆?。逆轉錄試劑盒、RNA裂解液(Trizol)及熒光定量PCR試劑購自Takara公司，BCA法蛋白定量試劑盒及PVDF膜購自Pierce公司，ECL發(fā)光液購自凱基生物公司，兔抗人USP18抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體、及鼠、兔二抗均購自proteintech公司，SP二步法試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1蛋白免疫印跡法 提取組織蛋白并測濃度后，取等量的總蛋白變性后經10%SDS．PAGE凝膠電泳，濕轉法轉印至PVDF膜上，室溫下用5%的封閉血清BSA封閉1 小時，兔抗人USP18抗體(1:300)、β-actin鼠抗人單克隆抗體(1:1000)稀釋，4℃孵育過夜，次日用含0.1% 吐溫的TBS(PBST)緩沖液漂洗5 分鐘，重復三次，加入抗兔或抗鼠(1:10000)二抗，室溫孵育1小時，PBS-T漂洗5 分鐘，重復三次后常規(guī)顯色發(fā)光。

1.2.2實時定量PCR 采用Trizol裂解組織后，提取RNA并測濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA后，進行實時定量PCR檢測。引物序列：USP18上游 5'-CCTGAGGCAAATCTGTCAGTC- 3' 和 5'-CGAACACCTGAATCAAGGAG TTA-3'；GAPDH 上游 5'-GTCCACCAC CCTG TTGCTGTA-3'、下游：5'-CTTCAACA GC GACACCCACTC-3'。GADPH基因作為參照基因。PCR反應體系20ul，反應條件：95℃預變性2 分鐘，95℃變性 10秒，58℃退火40秒，72℃延伸 30秒，共40個循環(huán)。導出PCR目的基因和參照基因的Ct值，計算2-ΔΔCt值進行相對定量。2-ΔΔCt值越大，說明該基因的表達量越高，實驗重復3次。

1.2.3免疫組化 石蠟組織連續(xù)切片后，經脫蠟脫水后，檸檬酸高溫高壓5 分鐘進行抗原修復，依次孵育一抗和二抗，DAB顯色。USP18以細胞漿和細胞核內出現淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞，根據顯微鏡下腫瘤細胞的染色范圍分為4個等級：0分：陽性細胞數<5%；1分：陽性細胞數5%～25%；2分：陽性細胞數26%～50%；3分：陽性細胞數>50%；依據對每張切片陽性細胞的染色強度進行評定，0分：無著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。兩者計分的乘積作為染色結果的評判標準：陰性(-)：0分；弱陽性(+)：1～4分；陽性(++)：5～8分；強陽性(+++)：9～12分。

1.3統(tǒng)計學方法 分析采用SPSS20．0進行數據分析，USP18的表達水平和臨床病理相關資料的相關性采用Wilcoxon Signed Ranks檢驗分析和Spearman相關分析。

2結 果

2.1在新鮮結直腸癌組織中的表達 在40例新鮮的結直腸癌組織中，mRNA水平上，有26例CRC組織中USP18蛋白的表達顯著高于正常黏膜組織，14例低于正常黏膜組織(圖1A)。統(tǒng)計分析結果顯示：CRC組織中USP18的表達水平顯著高于正常結直腸黏膜組織中的表達量(P=0.006)(圖1B)。蛋白水平上，在8例配對組織中，有7例CRC組織中USP18蛋白的表達顯著高于正常黏膜組織，1例低于正常黏膜組織(圖1C)。

圖1：USP18在40對新鮮結直腸癌組織mRNA水平(圖A: N:正常組織，T：癌組織，圖B：*P=0.006)和8對新鮮結直腸癌組織中蛋白檢測 (圖C: β-Actin為內參)

2.2在結直腸癌石蠟組織中的表達情況 USP18的表達定位于胞漿與胞核，在結直腸癌組織中，USP18 的表達率為95.7%%，癌旁正常黏膜組織中的表達率為25.3%，結直腸癌組織中USP18的表達要明顯高于癌旁正常粘膜組織(圖2)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(Z=-5.876，P<0.001)。

2.3結直腸癌組織中USP18蛋白表達及臨床病理參數的關系 分析結果顯示：癌組織中USP18表達的高低與腫瘤分化程度、是否有遠處轉移及淋巴結轉移有關，均P<0.05，而與腫瘤患者的性別、年齡、浸潤深度無關，P>0.05。見表1。

圖2USP18 在正常組織和癌組織的表達(A圖：正常組織40X10倍，B圖：癌組織，40X10倍)。

參數例數高表達低表達Pλ2年齡0.3430.899<6030219>=60846618性別87270.1631.944男725814女422913分化程度0.00112.487高41347中503713低23167是否遠處轉移0.0404.197否795623是35314淋巴結轉移0.0039.002是58526否563521浸潤深度0.3051.469累及全層28199未累及全層866818

3討 論

本文主要探討了USP18在結直腸癌新鮮組織及石蠟組織中的表達情況。USPl8位于染色體22q11.2，是一種泛素特異性蛋白酶，也是類泛素干擾素刺激基因15(ISGl5)[8, 9]。USP18在調節(jié)細胞信號通路中起著很重要的作用，包括p53相關細胞的存活，NF-κB的活性等，USPl8的增加，會使信號處理途徑、細胞增殖異常，胸腺T細胞凋亡。因此，USP18與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展也是密切相關的。目前關于USP18在腫瘤中的作用報道較少,僅見于少數幾種腫瘤如乙肝病毒相關的膀胱癌[6]、肝細胞癌[7]、黑色素瘤[10]、乳腺癌[11]、腎癌[12]和前列腺癌[13]等。而在結直腸癌中尚未見報道。

本研究首先檢測了USP18在40例配對新鮮結直腸癌組織中的mRNA水平及8例配對新鮮結直腸癌組織中的蛋白水平。結果發(fā)現，USP18在結直腸癌組織中的mRNA及蛋白水平均明顯高于正常組織。而后我們在114例配對結直腸癌石蠟組織中檢測了USP18的表達情況。結果顯示結直腸癌組織中的表達要明顯高于癌旁正常粘膜組織。結合臨床病理資料分析發(fā)現，USP18的表達與分化程度、遠處轉移及淋巴結轉移密切相關，而與腫瘤患者的性別、年齡、浸潤深度無關。這表明結直腸癌組織中USP18的升高可能與結直腸癌的增殖和轉移相關。研究報道[14]顯示USP18在白血病的潛伏期和發(fā)展期有重要的調節(jié)作用[14]；乳腺癌細胞株MCF-7中USP18的缺失可以誘導由化療和干擾素α(IFN-α)引起的凋亡的增加[15]；沉默USP18，同樣也能引起膠質母細胞瘤凋亡的增加[16]；敲低USP18后，可以直接導致急性早幼粒細胞白血病(APL)細胞增殖降低和凋亡增加，可以作為治療APL的一個臨床抗腫瘤治療靶點[17]。這些報道都說明USP18與腫瘤的增殖及發(fā)展有密切的關系。在機制方面，目前有研究報道[18,19]稱USP18影響腫瘤的發(fā)展主要是通過調控干擾素信號通路，因為IFNs可以抑制蛋白質ISGylation從而在抗腫瘤應答中起重要作用。另有研究報道[11]顯示USPl8基因的缺失能夠抑制腫瘤活性，可以通過上調Cxcr3配體來調節(jié)腫瘤微環(huán)境，尤其是CxcllO；USPl8還可以調控CD4+T細胞的抗腫瘤作用[20]；活化的UBP43酶可以直接影響細胞周期蛋白D1的穩(wěn)定性：敲除UBP43可以抑制細胞周期蛋白D1的表達，促進細胞凋亡[13]。在后續(xù)的研究中，我們將著重研究USP18促進結直腸癌侵襲和增殖的分子機制及其在臨床治療中的應用價值。

綜上所述，本實驗結果表明，USP18在結直腸癌組織中呈高表達，且與結直腸癌的遠處轉移和淋巴結轉移密切相關，提示USP18可能參與結直腸癌的發(fā)生、進展和轉移。本研究為結直腸癌的治療提供一個新的潛在靶點。