激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)

蔣瑋，曹林忠,2*，鄔明峻，張琪

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 蘭州 730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科，蘭州 730020)

1957年由Pietrogramde和Mastomarine第一次提出短時(shí)間大劑量可的松會(huì)引起股骨頭壞死(osteoarthrosis of femoral head, ONFH)之后，人們逐漸認(rèn)識(shí)到長(zhǎng)期服用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致激素性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH)的發(fā)生。然而激素在人體內(nèi)引起ONFH的機(jī)制尚不明確，主要有脂肪代謝紊亂、血管內(nèi)凝血和骨質(zhì)疏松三種假說[1]。激素進(jìn)入人體后會(huì)影響內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，導(dǎo)致血脂增高，易堵塞微小血管，進(jìn)而引起股骨頭局部缺血壞死；股骨頭壞死患者的血液粘稠度高，在激素的刺激下，容易發(fā)生高凝狀態(tài)及血管內(nèi)凝血，從而出現(xiàn)股骨頭缺血壞死；骨量減少、骨小梁變細(xì)、變薄是激素的副作用之一，在外部應(yīng)力的作用下，股骨頭常發(fā)生軟骨下骨折、局部塌陷導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，引起股骨頭缺血壞死[2]。

隨著研究不斷深入，SANFH研究進(jìn)入細(xì)胞、分子及基因領(lǐng)域，主要有激素代謝紊亂、干細(xì)胞分化和基因多態(tài)三種假說。有研究者[3]發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)細(xì)胞色素P4503 A酶的活性與糖皮質(zhì)激素清除成正相關(guān)，酶活性的降低可導(dǎo)致體內(nèi)激素作用時(shí)間增加，副作用也隨之增加，最終導(dǎo)致股骨頭壞死。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素會(huì)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂分化、減少成骨分化，導(dǎo)致股骨頭壞死。mRNA作為調(diào)節(jié)因子，調(diào)控細(xì)胞的整個(gè)生命周期，但它是否參與SANFH的發(fā)生，當(dāng)今尚不清楚，吳興凈等[4]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-125α-3p和下調(diào)的 miR-17-5p可能參與激素性股骨頭壞死的發(fā)生，但還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

然而無論是三種壞死機(jī)制假說，還是更進(jìn)一步的細(xì)胞、分子及基因研究，SANFH動(dòng)物模型的建立是研究的基礎(chǔ)，本文就以“激素性股骨頭壞死及，造?！睘闄z索詞在CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)中，從2009年01月01日至今，共檢索出相關(guān)文獻(xiàn)190篇；以“animal model of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head”為詞條在PubMed中共檢到文獻(xiàn)58篇。按照①股骨頭壞死；②激素性；③股骨頭壞死病因及機(jī)制；④動(dòng)物模型；⑤造模方案；⑥造模成功標(biāo)準(zhǔn)，符合其中多項(xiàng)或一項(xiàng)為入選標(biāo)準(zhǔn)，排除較陳舊、相似或重復(fù)研究的文章，最終選擇37篇文章進(jìn)行分析、歸納、總結(jié)，將最近10年來國(guó)內(nèi)外對(duì)造模方案、動(dòng)物選擇及造模成功標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，為SANFH動(dòng)物模型建立提供參考。

1 SANFH造模方案的選擇

激素在動(dòng)物和人體中有大致相似的作用機(jī)制，為了建立與人類SANFH病因及發(fā)病過程相似的動(dòng)物模型，總結(jié)常用SANFH的建模方法有單純糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)、異體血清聯(lián)合激素誘導(dǎo)和脂多糖聯(lián)合激素誘導(dǎo)。糖皮質(zhì)激素可使血管膠原纖維和彈性纖維結(jié)構(gòu)和功能障礙，從而導(dǎo)致骨組織小動(dòng)脈的斷裂或栓塞，導(dǎo)致骨細(xì)胞缺血和骨髓內(nèi)高壓引起股骨頭壞死，糖皮質(zhì)激素還可抑制干細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)向脂肪細(xì)胞分化，導(dǎo)致SANFH的發(fā)生[5]。然而大部分患者因?yàn)檠?、免疫系統(tǒng)或其他疾病，使用激素治療時(shí)，出現(xiàn)了股骨頭壞死的副作用。所以為了模擬這一發(fā)病過程，常使用異體血清制造模型動(dòng)物的血液和脈管系統(tǒng)炎癥，或者使用脂多糖引起微循環(huán)障礙，再使用激素干預(yù)，最終形成SANFH。

1.1 糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)

糖皮質(zhì)激素的使用是導(dǎo)致SANFH的主要原因。常用的糖皮質(zhì)激素有醋酸潑尼松龍、地塞米松、甲基強(qiáng)的松龍和甲基氫化潑尼松琥珀酸鈉等。不同激素和使用劑量的不同對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有不同的影響。范武等[6]通過每周2次日本大耳兔左側(cè)臀肌注射10 mg/kg的醋酸潑尼松龍注，連續(xù)4周后成功造模。趙振廣等[7]給大鼠每周2次腹腔注射地塞米松10 mg/kg，持續(xù)8周的方案成功建立SANFH的早期模型。Kuribayashi等[8]通過肌肉注射甲基強(qiáng)的松龍20 mg/(kg·d)的方式建立兔SANFH模型，4周后有70%的發(fā)生ONFH，然而在肌肉注射甲基強(qiáng)的松龍后，有20%的試驗(yàn)動(dòng)物死亡。王榮田等[9]用雌性來航雞，每周2次胸肌注射甲基氫化潑尼松琥珀酸鈉5.2 mg/(kg·week)，預(yù)防性注射青霉素2×104U/kg、鏈霉素50 mg/kg，連續(xù)8周后造模成功。但李興國(guó)等[10]通過新西蘭大白兔雙側(cè)臀肌連續(xù)9周注射地塞米松2.5 mg/(kg·d)，并且連續(xù)1周臀部肌注8×104U/d慶大霉素，未成功造模，且動(dòng)物死亡率高達(dá)25%。

單純糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)SANFH模型的方法優(yōu)點(diǎn)在于制模過程操作簡(jiǎn)單，所用藥物價(jià)格便宜，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較輕，但SANFH患者?；加卸喾N基礎(chǔ)疾病，所以單純使用激素制模與人類實(shí)際發(fā)病過程有較大的差異。也有研究者表明[11]單純激素不能成功誘導(dǎo)SANFH動(dòng)物模型，這一結(jié)論還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

1.2 異體血清加激素誘導(dǎo)

為了使建立的模型更有說服力，發(fā)病過程與人類相似，常使用異體血清制造模型動(dòng)物的血液和脈管系統(tǒng)炎癥，再加入激素干預(yù)進(jìn)行造模。1992年,Matsui等[12]首次通過兔耳緣靜脈注射馬血清10 mL/kg，2周后再次注射相同劑量，同時(shí)連續(xù)3天腹腔注射40 mL/(kg·d)的甲基強(qiáng)的松龍，4周后能在組織切片上觀察到骨髓壞死，6～8周后出現(xiàn)骨壞死，最終70%的動(dòng)物成功制作SANFH模型。周正新等[13]兔耳緣靜脈注射馬血清10 mL/kg，第3周后，注射劑量為7.5 mL/kg，第5周后，連續(xù)3天45 mg/(kg·d)的甲基強(qiáng)的松龍，之后連續(xù)10周腹腔注射7.5 mg/(kg·week)的甲基強(qiáng)的松龍，并臀部肌注4萬單位/只青霉素鈉預(yù)防感染后成功造模。佟鵬等[14]通過間隔12周兔耳緣靜脈注射兩次馬血清10 mL/kg后，連續(xù)6天，臀肌注射8 mg/(kg·d)的醋酸潑尼松龍，以80%的成功率獲得SANFH模型。

馬血清進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，因免疫反應(yīng)使動(dòng)物出現(xiàn)血管炎型超敏反應(yīng)，導(dǎo)致血管局部免疫復(fù)合物的沉積，并在免疫系統(tǒng)等的參與下，引發(fā)一系列的反應(yīng)致組織損傷，進(jìn)一步使用糖皮質(zhì)激素引發(fā)SANFH[15]，這一過程很好的模擬了人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

1.3 脂多糖聯(lián)合激素誘導(dǎo)

革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中有一種特殊物質(zhì)，叫做脂多糖，它能促進(jìn)血管活性物質(zhì)如緩激肽、組胺、血管緊張素、白介素-6等物質(zhì)釋放，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行激素的干預(yù)，最終導(dǎo)致ONFH[16]。李瑞琦等[17]對(duì)兔連續(xù)3 d肌肉注射青霉素4×105U預(yù)防感染后，間隔24 h耳緣靜脈連續(xù)兩次注射20 μg/kg內(nèi)毒素，第二次注射完畢內(nèi)毒素后，每間隔24 h臀肌注射20 mg/kg甲基強(qiáng)的松龍，此后每周2次肌肉注射4×105U青霉素預(yù)防感染，注射期間動(dòng)物死亡3/21，4周后成功建立SANFH模型。阮康明等[18]通過犬耳緣靜脈間隔24 h連續(xù)兩次注射10 μg/kg內(nèi)毒素，在第二次注射內(nèi)毒素的同一天開始，連續(xù)注射2周，臀肌注射甲基強(qiáng)的(10 mg/kg)，間隔1周后，再繼續(xù)注射2周，成功獲得模型。Zheng等[19]對(duì)鴯鹋序貫注射內(nèi)毒素及甲基強(qiáng)的松龍，也成功獲得SANFH的臨床前期研究的模型。于鵬等[20]對(duì)兔間隔24 h連續(xù)兩次靜脈注射10 μg/kg大腸桿菌內(nèi)毒素后，間隔24 h連續(xù)3次臀肌注射20 mg/kg醋酸潑尼松龍，注射完成后周第四以28/32的比率獲得SANFH動(dòng)物模型。王泳等[21]完全按照Yamamoto等[22]的方法制作動(dòng)物模型，內(nèi)毒素100 μg/kg聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍20 mg/kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射內(nèi)毒素后2 d內(nèi)死亡率接近80%，但將內(nèi)毒素的劑量降低至20 μg/kg，動(dòng)物的死亡率下降至不到10%，并通過組織形態(tài)學(xué)檢查得出了與高劑量制模方法一致的病理結(jié)果。還有研究者[8]發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素聯(lián)合激素組比馬血清聯(lián)合激素組稍早出現(xiàn)股骨頭壞死。肖春生等[23]經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)成立。也有研究者[24]發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素導(dǎo)致的股骨頭組織中腫瘤因子α明顯增高，提示該方法導(dǎo)致的ONFH可能與腫瘤因子密切相關(guān)，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。所以小劑量脂多糖聯(lián)合激素能成功制造SANFH模型，且具有動(dòng)物模型發(fā)病機(jī)制與人類相似，成功率高，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率低的優(yōu)點(diǎn)。

2 模型動(dòng)物的選擇

為了模型動(dòng)物盡可能的與人類有相似的SANFH發(fā)生過程，模型動(dòng)物應(yīng)有以下特點(diǎn)：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類親緣。②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物盡可能從組織學(xué)、生理學(xué)模擬人類SANFH的整個(gè)過程。③生物力學(xué)效應(yīng)與人類相似。④實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有良好的重復(fù)性，有明確的制模成功評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、價(jià)格低廉、飼養(yǎng)方便[25]。目前造模常用動(dòng)物是以雞為代表的雙足類動(dòng)物和以大鼠及兔子為代表的四足類動(dòng)物[26]。

2.1 雙足類動(dòng)物

生物力學(xué)效應(yīng)與人類相似的雙足類動(dòng)物，在站立行走時(shí)雙側(cè)股骨頭均受壓，一旦出現(xiàn)局部缺血壞死，在集中應(yīng)力的作用下，病程進(jìn)展較迅速。且雙足類動(dòng)物大多為禽類，在進(jìn)食高脂肪飼料或激素刺激后易出現(xiàn)血脂增高和血液粘滯性增高，易形成股骨頭缺血壞死。萬蓉等[27]、孔祥英等[28]通過胸肌注射甲基潑尼松琥珀酸鈉后成功獲得雞SANFH模型。曲春濤[29]采用液氮冷凍并射頻加熱交替法損傷股骨頭建立鴯鹋股骨頭塌陷模型。但禽類動(dòng)物與人類親緣性較遠(yuǎn)，生理生化方面與哺乳動(dòng)物有較大的差別。

2.2 四足類動(dòng)物

四足類動(dòng)物與人類具有相似的生理生化及基因，常用的四足類動(dòng)物有大鼠和兔，其次還有犬、綿羊等動(dòng)物。為了避免物理或化學(xué)刺激后產(chǎn)生的疼痛，四足類動(dòng)物常出現(xiàn)減少患肢負(fù)重的保護(hù)性行為，減少了生物力學(xué)效應(yīng)在ONFH過程中的作用。針對(duì)這一問題Mihara等[30]通過強(qiáng)迫四肢動(dòng)物站立，增加造模成功率。有研究者[31]在其它條件相同的前提下，僅通過調(diào)整飼料高度迫使實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物站立取食，并予跑步機(jī)跑步2 h/d增加運(yùn)動(dòng)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組造模成功率提高約15%。

犬因體型較大，常用于建立創(chuàng)傷性O(shè)NFH模型。鞏建寶等[32]、謝志濤等[33]分別使用液氮冷凍法和內(nèi)毒素聯(lián)合甲強(qiáng)龍成功建立犬ONFH模型。羊長(zhǎng)骨內(nèi)脂肪豐富，適合建立減壓性O(shè)NFH模型，但犬和羊價(jià)格昂貴，場(chǎng)地要求高，飼養(yǎng)不便利，不經(jīng)常用于實(shí)驗(yàn)研究。相比于犬和羊，大鼠、兔沒有上述顧慮，大鼠壽命較短，可以用于早期ONFH模型建立，但不利于晚期塌陷模型的建立。兔體型適中，飼養(yǎng)便利，壽命較長(zhǎng)，是良好的動(dòng)物模型的選擇對(duì)象。

3 造模成功的標(biāo)準(zhǔn)

驗(yàn)證動(dòng)物模型是否制備成功，是實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵步驟。常用的驗(yàn)證方法有影像學(xué)評(píng)估、病理學(xué)驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室檢查以及形態(tài)學(xué)觀察等。

3.1 影像學(xué)評(píng)估

影像學(xué)評(píng)估是最簡(jiǎn)便的方法，國(guó)際骨循環(huán)學(xué)會(huì)(Association Research Circulation Osseous, ARCO)對(duì)股骨頭壞死的分期：0期和Ⅰ期ONFH動(dòng)物行髖關(guān)節(jié)正位X線和普通CT結(jié)果無異常表現(xiàn)，對(duì)此趙振廣等[7]研究者已做過相關(guān)驗(yàn)證。股骨頭X線表現(xiàn)為斑片狀陰影，硬化及囊腫形成，但股骨頭無塌陷，為II期；表現(xiàn)為骨性關(guān)節(jié)面的下方出現(xiàn)新月形透明帶，即“新月征”，則為III期；表現(xiàn)為股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)間隙變窄，囊性變等，為IV期。普通CT可較X線早發(fā)現(xiàn)II期股骨頭壞死。Micro-CT能檢測(cè)骨小梁骨微結(jié)構(gòu)的定量指標(biāo)[34]，能發(fā)現(xiàn)I期ONFH骨小梁變細(xì)、變薄甚至斷裂，但Micro-CT不能顯示軟組織及股骨頭內(nèi)骨髓、脂肪變化，不能發(fā)現(xiàn)0期股骨頭內(nèi)骨髓及脂肪變化，且檢查費(fèi)用昂貴不常使用。MRI可將股骨頭外形、關(guān)節(jié)間隙、關(guān)節(jié)積液、股骨頭內(nèi)信號(hào)均勻程度、骨髓是否水腫以及骨壞死信號(hào)等均能顯現(xiàn)。T1 WI上表現(xiàn)為點(diǎn)狀、細(xì)線狀、片狀低信號(hào)強(qiáng)度，T2 WI上表現(xiàn)為點(diǎn)狀、細(xì)線狀、片狀高信號(hào)強(qiáng)，脂肪抑制序列呈現(xiàn)高信號(hào)示骨髓水腫，為0期ONFH，張林波等[35]做過相關(guān)驗(yàn)證。還有學(xué)者采用血管造影的方法觀察股骨頭內(nèi)毛細(xì)血管情況，發(fā)現(xiàn)造模后股骨頭內(nèi)毛細(xì)血管明顯減少并迂曲，但無法顯示微小動(dòng)脈狀況，且無法判斷股骨頭壞死處于那一期，使用較少。

3.2 病理學(xué)檢查

病理學(xué)檢查是驗(yàn)證造模成功的金標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物處死后取股骨頭制作病理切片，觀察到空骨陷窩數(shù)量增加，骨細(xì)胞中脂滴充滿，細(xì)胞核被擠向邊緣，骨髓造血組織減少，脂肪細(xì)胞堆積骨小梁稀疏、變細(xì)變薄，甚至斷裂，骨細(xì)胞核固縮溶解、消失，成骨細(xì)胞消失，脂肪組織和增大的脂肪細(xì)胞占據(jù)骨髓區(qū)，按ARCO標(biāo)準(zhǔn)，為0期股骨頭壞死。李傳將等[36]、陳達(dá)等[37]、李磊等[38]經(jīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。雖然病理學(xué)檢查標(biāo)本能檢測(cè)出超早期股骨頭壞死，但需處死動(dòng)物后才能得到切片，若需后續(xù)在體實(shí)驗(yàn)，將無法逐一進(jìn)行驗(yàn)證，動(dòng)物因個(gè)體差異將存在實(shí)驗(yàn)誤差。

3.3 實(shí)驗(yàn)室檢查及形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)血液中血清膽固醇和甘油三酯均升高，股骨頭內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定減慢。但無法確定股骨頭壞死處于那一期。此外動(dòng)物造模過程中和完成后常出現(xiàn)毛發(fā)、飲食、步態(tài)以及消瘦狀況等形態(tài)學(xué)改變，動(dòng)物注射藥物后出現(xiàn)精神萎靡、皮毛欠光滑、大便稀、飲食減少、跛行、活動(dòng)減少等癥狀，部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還出現(xiàn)潰瘍、脫毛等癥狀[39]。

總的來說，早期SANFH造模成功主要依靠MRI及病理學(xué)的驗(yàn)證。

4 展望

人和動(dòng)物存在較大的差異，動(dòng)物模型的制備過程應(yīng)盡可能的模擬與人類發(fā)病相似的自然病程和病理過程，但沒有一種理想的動(dòng)物及造模方法可以完全復(fù)制。動(dòng)物模型的制備周期、制模成功率、制模成本均對(duì)實(shí)驗(yàn)有較大的影響。綜上所述，不同的動(dòng)物在不同的模型建立上有各自的優(yōu)勢(shì)，但沒有一個(gè)完美的動(dòng)物能建立與人類疾病發(fā)生極度相似的模型，根據(jù)自己不同的研究目的研究者應(yīng)選擇不同的動(dòng)物模型及制模方案。綜上所述，SANFH制模方案選擇異體血清聯(lián)合激素或者小劑量、高頻率脂多糖聯(lián)合激素，并給予強(qiáng)迫站立體位，加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)來可增加制模成功率，給予藥物的同時(shí)給予胃黏膜保護(hù)藥物以降低動(dòng)物死亡率。建立良好的SANFH模型是研究SANFH的關(guān)鍵，相信隨著研究不斷地深入，研究方法不斷地改進(jìn)，更好的動(dòng)物模型將會(huì)建立，用以SANFH的預(yù)防和治療研究。