缺血再灌注脊髓損傷動(dòng)物造模研究進(jìn)展

王雨榕，鄧強(qiáng)，郭鐵峰，彭冉東，李軍杰，徐浩軍

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000； 2. 甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050)

在脊柱外科疾病中，脊髓損傷是最為常見(jiàn)的嚴(yán)重疾病之一，常引起嚴(yán)重的不可逆肢體功能障礙，致殘率、致死率較高，成為國(guó)內(nèi)外脊柱外科領(lǐng)域急待解決的重大醫(yī)學(xué)難題之一。其中，脊髓缺血再灌注損傷是導(dǎo)致脊髓功能不可逆損傷的一個(gè)主要因素，可導(dǎo)致脊髓功能長(zhǎng)期的不可逆性損害，臨床表現(xiàn)為急性或遲發(fā)性的肢體癱瘓，并且由于治療手段貧乏，最終可導(dǎo)致死亡，造成嚴(yán)重的健康影響和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。在脊髓缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)研究中，損傷后的低灌注區(qū)為脊髓損傷中心和缺血半暗帶區(qū)，此區(qū)域常有水腫、血脊髓屏障的破壞及內(nèi)皮滲透功能的紊亂和微血管自主調(diào)節(jié)功能的障礙[2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，城鎮(zhèn)化加速及交通、建筑事故增多，脊髓損傷的發(fā)病率越來(lái)越高，由于脊髓缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制比較復(fù)雜，其相關(guān)研究不夠深入，臨床治療缺乏有效快速的治療方法。因此，在脊髓損傷的相關(guān)研究中建立脊髓缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型對(duì)新藥的開(kāi)發(fā)、治療手段的改進(jìn)有重要意義。目前雖然脊髓損傷造模方法較多，但用于研究脊髓缺血再灌注損傷仍然缺乏有效、簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型。

1 SCII造模動(dòng)物及其優(yōu)缺點(diǎn)

SCII造模的目的是通過(guò)對(duì)動(dòng)物脊髓缺血再灌注損傷的觀察，從而推斷人類(lèi)脊髓缺血再灌注損傷的各種機(jī)理，所以從解剖生理上講，造模選用的動(dòng)物越接近人類(lèi)就越容易越可靠地觀察到脊髓缺血再灌注損傷后的機(jī)體功能情況。其造模所用的動(dòng)物種類(lèi)較多，包括狨猴、獼猴和松鼠猴等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，貓、家兔、狗、綿羊等大中型動(dòng)物，以及相對(duì)便宜、容易獲得的大鼠。

1.1 與人類(lèi)相似的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物

進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的目的主要是用來(lái)防治人類(lèi)的疑難疾病，并且在指導(dǎo)用藥及研發(fā)新藥中起著重要的作用，所以，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模中，選取越高級(jí)的動(dòng)物越能更接近的模擬人類(lèi)發(fā)生疾病時(shí)復(fù)雜的病理生理過(guò)程。在脊髓損傷及其相關(guān)疾病研究中，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物因?yàn)樽罱咏祟?lèi)而被選為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要有獼猴和恒河猴，如唐濤等[3]利用獼猴研究急性脊髓全橫斷損傷血清的代謝組學(xué)，得出全橫斷脊髓損傷急性期的代謝改變主要以能量代謝和氨基酸代謝為主的結(jié)論。馬小翠等[4]成功構(gòu)建獼猴脊髓損傷模型并建立及評(píng)價(jià)了獼猴脊髓損傷研究長(zhǎng)時(shí)程麻醉方案。趙文等[5]用成年雌性恒河猴研究脊髓損傷后恒河猴雙下肢體重支撐的改變。雖然靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與人類(lèi)相似度較高，但由于其不易飼養(yǎng)，國(guó)內(nèi)外可提供的獼猴與恒河猴較少，且很難達(dá)到SPF級(jí)甚至更高級(jí)的要求。所以其缺點(diǎn)顯而易見(jiàn)：(1)不容易獲得，一般實(shí)驗(yàn)室很難復(fù)制實(shí)驗(yàn)，缺乏可重復(fù)性；(2)難以飼養(yǎng)，造模后護(hù)理困難，可控性不高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)容易受到各種因素的干擾；(3)從資金方面來(lái)講，投資較大，不適合大樣本實(shí)驗(yàn)。(4)動(dòng)物倫理審查嚴(yán)格。隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的發(fā)展，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的審查要求也越來(lái)越嚴(yán)格。雷瑞鵬等[6]等在探討非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理問(wèn)題時(shí)，提出了三個(gè)問(wèn)題：利用靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)是否是科學(xué)的需要？靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物在研究中受到的傷害、痛苦是否應(yīng)受到充分的考慮？對(duì)于與人類(lèi)相近的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，它們具有一定的道德地位，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)研究時(shí)應(yīng)該如何對(duì)待？對(duì)于這些問(wèn)題，他們建議應(yīng)該遵循的倫理標(biāo)準(zhǔn)有：認(rèn)真的評(píng)估傷害-受益比；嚴(yán)格落實(shí)3R原則(替代原則、減少原則、優(yōu)化原則)；充分體現(xiàn)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的道德地位與內(nèi)在價(jià)值；積極承擔(dān)責(zé)任，建立和規(guī)范靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物代理人制度；將靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行獨(dú)立的倫理審查。此外，動(dòng)物等級(jí)越高，動(dòng)物福利要求就越高，從而增加了實(shí)驗(yàn)研究的難度。

1.2 中型或小型動(dòng)物

可用于實(shí)驗(yàn)研究的中小型動(dòng)物很多，如綿羊、家兔、大鼠、小鼠等都可以用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。如黃軒等[7]用綿羊通過(guò)經(jīng)皮硬膜外置管法建立急性頸脊髓損傷模型。Durdag等[8]用新西蘭兔造模研究論維加特林的神經(jīng)保護(hù)作用。但是大多脊髓缺血再灌注損傷研究多選擇大鼠和家兔為主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要原因是大鼠和家兔具有價(jià)格便宜，便于飼養(yǎng)，可用于大樣本實(shí)驗(yàn)，并且其脊髓血管解剖結(jié)構(gòu)與人類(lèi)大致相似等優(yōu)點(diǎn)。中小型動(dòng)物的缺點(diǎn)有：(1)與人類(lèi)病理生理相似性較低，研究局限性較高。(2)體型相對(duì)較小，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)死亡率較高，其中大小鼠在造模過(guò)程中，由于藥物劑量及實(shí)驗(yàn)者力度難以把控等容易造成死亡。

綜上，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇在研究SCII過(guò)程中非常重要，要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)方法和目的以及科研經(jīng)費(fèi)選擇切合實(shí)際的動(dòng)物造模，盡量制備出理想的脊髓損傷模型，使其具備臨床相似性、可控制性、可重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用性。

2 SCII模型分類(lèi)

脊髓缺血再灌注模型種類(lèi)繁多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)方法及目的選擇，但在造模過(guò)程中缺血部位和缺血再灌注方式上存在爭(zhēng)議。無(wú)論選擇何種方法，目的都是尋找最簡(jiǎn)便有效、更易達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模腋咏祟?lèi)脊髓缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型，為實(shí)驗(yàn)研究提供便利?？偨Y(jié)常用的SCII造模方法，主要包括夾閉法、栓塞法、電凝灼閉法等。

2.1 夾閉法

夾閉法是脊髓缺血再灌注動(dòng)物造模最常用的一種方法，選擇夾閉的血管也比較多，主要包括夾閉腹主動(dòng)脈、腰動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈及脊髓背側(cè)中央靜脈等。最早Zivin等[9]夾閉兔腹主動(dòng)脈建立了脊髓損傷動(dòng)物模型，具體方法是將新西蘭兔以氯胺酮麻醉后，沿腹部正中線切開(kāi)，將腹主動(dòng)脈從左腎動(dòng)脈起點(diǎn)處分離，然后用動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈造成動(dòng)脈缺血，過(guò)幾分鐘后復(fù)流造成再灌注損傷。但是由于該造模方法需二次麻醉，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷較大，不利于術(shù)后護(hù)理，故為了解決該問(wèn)題，Zivin等[10]改進(jìn)了上述方法，避免了二次麻醉，推進(jìn)了脊髓缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究。此后Herlambang等[11]采用腎動(dòng)脈和主動(dòng)脈之間夾閉腹主動(dòng)脈，Kim等[12]采用夾閉腹主動(dòng)脈及其分支制作SCI大鼠模型。但是研究表明[13-14]，夾閉腹主動(dòng)脈同時(shí)會(huì)造成腹腔、盆腔臟器的缺血再灌注損傷，并發(fā)癥較多，張俐等[15]采用血管鑄型技術(shù)和數(shù)字減影造影技術(shù)建立及鑒定大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示脊髓血供主要來(lái)自腰動(dòng)脈, 從右腎動(dòng)脈上夾閉腹主動(dòng)脈，造成的缺血損傷面積廣泛，為最佳夾閉部位，且并發(fā)癥少，改進(jìn)了傳統(tǒng)造模方法的缺陷，是一種操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，更貼近臨床脊髓缺血再灌注損傷病理改變的一種造模方法。并且張俐等比較了夾閉腹主動(dòng)脈及腰動(dòng)脈兩種造模方法，發(fā)現(xiàn)夾閉腰動(dòng)脈的脊髓缺血再灌注損傷模型優(yōu)于夾閉腹主動(dòng)脈的模型。此外，Wang等[16]等采用夾閉胸主動(dòng)脈制成脊髓缺血再灌注損傷模型。但大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，無(wú)論夾閉那種動(dòng)脈，都會(huì)造成夾閉部位以下的組織缺血，如脊髓、腸、腎等組織缺血后，會(huì)產(chǎn)生炎性因子，這些炎性因子進(jìn)入脊髓組織后會(huì)在原有損傷的基礎(chǔ)上再次加重脊髓的損傷[17-18]。

雖然夾閉法雖然最為常用，但一定要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的夾閉血管，把握夾閉時(shí)間，避免造成其他臟器的缺血再灌注損傷或加重脊髓損傷的程度，諸多造模方法顯示，夾閉時(shí)間主要在30 ～ 40 min，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)及實(shí)驗(yàn)要求把握夾閉時(shí)間。

2.2 栓塞法

在阻斷血管的方式上，除直接用血管夾夾閉動(dòng)脈外，可以直接栓塞脊髓供血?jiǎng)用}。栓塞法是目前SCII造模比較先進(jìn)的一種方法，操作方法也比較復(fù)雜，目前主要栓塞方法主要借助數(shù)字減影血管造影技術(shù)(digital subtraction angiography，DSA)。王誼榮[19]將20只犬為研究對(duì)象，在DSA引導(dǎo)下采用Seldinger穿刺法，選在右側(cè)腹股溝的韌帶下方，以45°角進(jìn)行穿刺，將動(dòng)脈鞘(5F)置入，并將導(dǎo)管(4F)從中穿入胸、腹主動(dòng)脈。逐支對(duì)腰動(dòng)脈分支以4F導(dǎo)管進(jìn)行探尋，以平均粒徑560 μm左右的明膠海綿，栓塞其1 ～ 3條相應(yīng)的腰動(dòng)脈分支，以手動(dòng)法將栓塞劑注入，成功造成實(shí)驗(yàn)組犬發(fā)生尿潴留現(xiàn)象。秦治剛等[20]同樣采用DSA引導(dǎo)的方法，栓塞山羊1-3條腰動(dòng)脈，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均出現(xiàn)雙下肢癱瘓癥狀，成功制備出山羊缺血性脊髓損傷的模型。

由此可見(jiàn)，采用栓塞法制備脊髓缺血再灌注損傷模型常選用體積較大的動(dòng)物，并且要在DSA技術(shù)的引導(dǎo)下才能準(zhǔn)確栓塞血管。雖然該方法造模的成功率較高，也容易達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模€可以控制血管阻塞范圍和脊髓損傷程度，但由于儀器設(shè)備要求較高，制備過(guò)程復(fù)雜，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本升高，增加實(shí)驗(yàn)難度，并且該方法仍不可避免的造成其他器官的缺血再灌注損傷，對(duì)于術(shù)后動(dòng)物護(hù)理及實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定影響，因此不作為缺血再灌注脊髓損傷造模的首選方法。

2.3 電凝灼閉法

電凝灼閉法是使用電極電凝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊髓供血?jiǎng)用}，該方法主要造成脊髓缺血性損傷。金華等[21]改良大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，通過(guò)電凝腎上腹主動(dòng)脈發(fā)出的椎動(dòng)脈和結(jié)扎腎下腹主動(dòng)脈不同時(shí)間后再恢復(fù)血液灌注，該方法有效的阻斷了腰段脊髓血液供應(yīng)，并可控制脊髓缺血再灌注的損傷程度，證明改良后的脊髓缺血再灌注損傷模型是一種科學(xué)可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。Chen等[22]使用雙極電凝器電凝大鼠脊髓背側(cè)中央靜脈制作脊髓缺血損傷模型，該造模方法使用雙極電凝器能更好的限制熱擴(kuò)散，減少鄰近組織損傷，并發(fā)癥較少，模型制作成功率較高，值得推廣。

除上述方法外，Piao等[23]用孟加拉玫瑰紅激光束直接照射脊髓，通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)使脊髓微血管內(nèi)形成廣泛的微血栓，使脊髓出現(xiàn)缺血性損傷，并且該方法可通過(guò)控制照射劑量來(lái)造成不同程度的脊髓缺血。但該方法在實(shí)驗(yàn)研究中運(yùn)用較少，主要原因是操作流程不過(guò)范，缺乏大量數(shù)據(jù)支撐，并且實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高。不管是夾閉法、栓塞法還是電凝灼閉法，這些造模方法對(duì)研究人類(lèi)脊髓缺血再灌注損傷都有幫助，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證與改進(jìn)，更好的將其運(yùn)用到人類(lèi)脊髓缺血再灌注損傷疾病的研究中。

3 CSII造模成功標(biāo)準(zhǔn)

造模是否成功的觀察指標(biāo)主要包括行為學(xué)評(píng)價(jià)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)兩部分。宋偉等[24]在對(duì)比切割型脊髓損傷模型與切除型脊髓損傷模型時(shí)采用了后肢行為學(xué)BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分(Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale)，該評(píng)分方法采用雙人雙盲方法，在術(shù)前及術(shù)后固定的時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1，2，4，8，10，20，30，50周)將動(dòng)物放置于直徑2 m的開(kāi)放圓形平臺(tái)上，地對(duì)大鼠雙側(cè)后肢的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。 唐濤等[25]在造模后采用BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分、Grid Walking 評(píng)分(Grid Walking Test)、熱痛等三種方法，在大鼠術(shù)后不同時(shí)間段來(lái)記錄其行為學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要為組織病理學(xué)檢測(cè)，取材染色后可在顯微鏡下觀察，主要觀察壞死神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量的變化，鏡下表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞核的固縮或溶解。造模后，實(shí)驗(yàn)者要仔細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的表現(xiàn)，配合先進(jìn)儀器設(shè)備，準(zhǔn)確判斷CSII造模是否成功。

4 小結(jié)

由于人類(lèi)脊髓缺血再灌注損傷比較復(fù)雜，因此造模方法也多種多樣，但目的都是用最簡(jiǎn)便的方法制備最接近人類(lèi)SCII的動(dòng)物模型用以研究脊髓缺血再灌注損傷的機(jī)制、治療方法、用藥等。以上動(dòng)物模型的造模方法都可造成明確的脊髓缺血再灌注損傷，但同時(shí)也不可避免的造成其他器官的缺血再灌注損傷，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果造成一定影響，所以一定要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙筮x擇合適實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及缺血再灌注方式。由于家兔血液循環(huán)系統(tǒng)與人類(lèi)相似，且容易飼養(yǎng)，術(shù)后便于護(hù)理等優(yōu)點(diǎn)，目前SCII實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多傾向于家兔，并且已制備出完整家兔血管鑄形標(biāo)本，為實(shí)驗(yàn)研究提供解剖基礎(chǔ)。在諸多缺血再灌注方式中，夾閉腰動(dòng)脈避免了傳統(tǒng)造模方法的并發(fā)癥，是比較理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究中已推廣使用。

5 展望

脊髓缺血再灌注損傷模型在脊髓損傷的病因病理研究中占據(jù)非常重要的地位，雖經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，SCII造模方法已取得一定的成果，但是目前仍沒(méi)有完全復(fù)制SCII發(fā)病過(guò)程的方法，因此，在未來(lái)的研究中，我們要不斷改進(jìn)，繼續(xù)創(chuàng)新，盡可能為脊髓缺血再灌注損傷的研究提供更接近人類(lèi)SCII機(jī)制的動(dòng)物模型。此外，未來(lái)要建立規(guī)范合理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)展提供良好的發(fā)展空間，讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在醫(yī)學(xué)研究中更好發(fā)揮其自身價(jià)值。