A/Guangdong/Th005/2017(H7N9)禽流感病毒對(duì)禽類致病力的研究

呂琦，李楓棣，龔姝然，戚菲菲，王順意，王冠澎，姜靜，鮑琳琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

H7亞型在禽類間早已存在。有記載的最早疫情是1904年由H7N7亞型禽流感病毒導(dǎo)致的意大利雞瘟。此后H7亞型在自然界持續(xù)存在，并于2000年前后多次在意大利的雞群中爆發(fā)(H7N1/H7N3)[1]。截至2013年，H7亞型禽流感病毒已導(dǎo)致7000萬禽類死亡，波及區(qū)域遍布全球。2013年初，出現(xiàn)H7N9感染人的病例[2]。隨后H7N9持續(xù)流行，共發(fā)生5波大的流行，在2017年第5波流行開始，發(fā)生多起家禽疫情，禽類出現(xiàn)死亡，并且能從禽類體內(nèi)分離出H7N9禽流感病毒，H7N9病毒已從低致病性向高致病性轉(zhuǎn)變[3]。

H7N9對(duì)禽的致病力變化引起了多方的關(guān)注，為了確定第5波疫情中H7N9病毒株對(duì)禽的致病力，我們選用第5波H7N9分離株A/Guangdong/Th005/2017(Th005)，以第1波H7N9分離株A/Anhui/1/2013(Anhui)作為參比，通過測(cè)定雞IVPI確定2波流行株對(duì)禽致病力的變化；通過2株病毒感染雞后體溫、體重、臨床癥狀以及排毒情況分析比較2株病毒對(duì)雞的致病的特點(diǎn)；通過病毒在雞中的傳代實(shí)驗(yàn)分析H7N9禽流感病毒在禽體內(nèi)循環(huán)后病毒對(duì)禽致病力變化，以及病毒在禽中的流行趨勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

42只SPF級(jí)白來航雞，6周齡，體重為(600 ± 50)g，由北京勃林格殷格翰維通公司提供【SCXK(京)2014-0002】，對(duì)其進(jìn)行篩選，選出對(duì)于目前流行的流感病毒血清抗體(抗H1、H3、H5、H7)均為陰性者。感染實(shí)驗(yàn)按照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)指導(dǎo)原則，均在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行(衛(wèi)ABSL3-021)，所有操作經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：BLL17005)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循3R原則。

1.1.2 病毒

(1)H7N9禽流感病毒：A/Guangdong/Th005/2017(H7N9)(簡(jiǎn)稱Th005)由中國科學(xué)院微生物所惠贈(zèng)，A/Anhui/1/2013(H7N9)(簡(jiǎn)稱Anhui)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制研究所提供。

(2)Th005雞傳代株(簡(jiǎn)稱Th005 C)：由原代病毒靜脈感染實(shí)驗(yàn)雞，取實(shí)驗(yàn)雞死亡當(dāng)天的鼻拭子上清和肺部組織研磨液于雞胚中擴(kuò)增。

(3)Anhui雞傳代株(簡(jiǎn)稱Anhui C)：由原代病毒靜脈感染實(shí)驗(yàn)雞，取感染后第5天的鼻拭子上清于雞胚中擴(kuò)增。

1.1.3 試劑與儀器

RDE酶(receptor-destroying enzyme)(Sigma，C8772-1VL)，火雞血(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源北方中心)，胎牛血清(Gibco，16140-071)，青/鏈霉素(penicillin/streptomycin)雙抗生素溶液(Gibco，15140-122)，MEM培養(yǎng)基(Gibco，11095-098)。

生物安全柜(Thermo，1287，美國)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，371，美國)，-80℃超低溫冰箱(Thermo，905，美國)，15 mL、50 mL管離心機(jī)(Sigma，6K15，美國)，1 mL管臺(tái)式離心機(jī)(Kubota，日本)，電動(dòng)研磨器/均質(zhì)器 (Retsch，#MM400，德國)。

1.2 方法

1.2.1 Th005和Anhui毒株的雞靜脈注射致病指數(shù)IVPI評(píng)分的比較

Th005和Anhui毒株分別感染6周齡白來航雞，每組10只，雞翅下靜脈注射0.1 mL病毒稀釋液，病毒稀釋液采用生理鹽水10倍梯度稀釋，感染后連續(xù)10 d記錄實(shí)驗(yàn)雞臨床癥狀和死亡率。IVPI實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法參考世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International des épizooties, OIE)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：IVPI指數(shù)為每只雞為期10 d的平均臨床癥狀觀察分?jǐn)?shù)，24 h內(nèi)動(dòng)物完全死亡為3分，10 d內(nèi)動(dòng)物完全無癥狀為0分。評(píng)分1.3以上則判定病毒為高致病性禽流感病毒。癥狀評(píng)分：0為正常，1為生病，2為嚴(yán)重生病，3為死亡；以下癥狀中呈現(xiàn)一種為“生病”，呈現(xiàn)兩種或兩種以上為“嚴(yán)重生病”：呼吸系統(tǒng)相關(guān)癥狀、精神沉郁、腹瀉、頭冠發(fā)紫，頭面水腫，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

1.2.2 Th005、Th005 C、Anhui和Anhui C毒株感染雞致病力的比較

Th005、Th005 C、Anhui、Anhui C毒株分別滴鼻感染6周齡白來航雞，每組5只，感染劑量為每只106TCID50，感染后第0 ～ 14天，測(cè)定體重和肛溫；第0 ～ 7、9、11、14天收集咽、肛拭子測(cè)定病毒滴度。

1.2.3 滴度的測(cè)定

10倍梯度稀釋待檢測(cè)拭子，稀釋液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL病毒稀釋液，37℃，5%CO2，孵育1 h 后，吸走上清，培養(yǎng)板中加入200 μL病毒培養(yǎng)基(MEM 培養(yǎng)基中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)，3 d后，取細(xì)胞上清，用1%火雞血測(cè)定凝血活性，判定細(xì)胞感染情況。利用Reed-Muench計(jì)算組織細(xì)胞半數(shù)感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 11.5軟件包對(duì)本實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間的數(shù)據(jù)差異采用ANOVA單因素方差分析，兩組之間則采用t檢驗(yàn)分析組間差異是否顯著，P< 0.05 則認(rèn)為結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Anhui和Th005毒株的雞靜脈注射致病指數(shù)(IVPI)評(píng)分比較

靜脈感染Th005毒株后，實(shí)驗(yàn)雞1 d內(nèi)全部死亡，IVPI指數(shù)為3；感染Anhui株后，實(shí)驗(yàn)雞10 d內(nèi)均無臨床癥狀出現(xiàn)，IVPI指數(shù)為0。根據(jù)OIE文件中IVPI評(píng)判要求，Anhui株為低致病性禽流感毒株，Th005株為高致病性禽流感毒株。

2.2 Anhui和Th005及傳代株感染雞的致病力比較

2.2.1 Anhui和Th005及傳代株感染雞后臨床癥狀和體征比較

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分別滴鼻感染白來航雞，每組5只，連續(xù)稱重14 d，感染后Anhui 和Anhui C組實(shí)驗(yàn)雞體重持續(xù)增長，但Anhui C組比Anhui組實(shí)驗(yàn)雞體重增長更緩慢；Th005和Th005 C組實(shí)驗(yàn)雞均出現(xiàn)體重下降，兩組間雞體重下降率無顯著性差異(圖1)。

圖1 Anhui和Th005及其傳代株感染實(shí)驗(yàn)雞體重變化率Figure 1 Body weight change rate of the Anhui, Th005 and their progeny-infected chickens

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分別滴鼻感染白來航雞，每組5只，感染后連續(xù)14 d檢測(cè)體溫，Anhui和Anhui C組實(shí)驗(yàn)雞體溫在正常范圍內(nèi)波動(dòng)(40.5 ～ 42℃)，各組間體溫?zé)o顯著性差異；感染后第2天，Th005和Th005 C組實(shí)驗(yàn)雞體溫超過42℃，體溫超過正常范圍，此后感染雞體溫降低直至死亡，各組間體溫?zé)o顯著性差異(圖2)。

圖2 Th005、Anhui及其傳代株感染實(shí)驗(yàn)雞體溫變化Figure 2 Body temperature of the Anhui, Th005 and their progeny-infected chickens

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分別滴鼻感染白來航雞，每組5只，感染后14 d內(nèi)記錄雞的存活率，Anhui和Anhui C組實(shí)驗(yàn)雞在感染后14 d內(nèi)均未出現(xiàn)死亡；Th005和Th005 C組實(shí)驗(yàn)雞感染后3 ～ 5 d內(nèi)全部死亡(圖3)。

圖3 Th005、Anhui及其傳代株感染實(shí)驗(yàn)雞存活率Figure 3 Survival rate of the Anhui, Th005 and their progeny-infected chickens

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分別滴鼻感染白來航雞，每組5只，感染后14 d內(nèi)觀察雞的臨床癥狀和體征變化，Anhui組實(shí)驗(yàn)雞無癥狀，Anhui C組實(shí)驗(yàn)雞在感染后第5天出現(xiàn)了一過性頭面水腫及結(jié)膜炎，癥狀持續(xù)1 d后消失；Th005和Th005 C組實(shí)驗(yàn)雞在感染后第2天出現(xiàn)食欲降低，進(jìn)食量減少，感染后第3天開始出現(xiàn)精神沉郁、體表瘀斑、肉垂紫紺、頭面水腫和死亡(圖4)。

2.2.2 Anhui和Th005及其傳代株感染雞后排毒情況比較

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分別滴鼻感染白來航雞，每組5只，感染后第0 ～ 7、9、11、14天收集咽、肛拭子測(cè)定病毒滴度。Anhui和Anhui C組實(shí)驗(yàn)雞咽拭子未檢測(cè)到病毒滴度；Anhui組實(shí)驗(yàn)雞肛拭子未檢測(cè)到病毒滴度，Anhui C組肛拭子在感染后第2 ～ 9天能夠檢測(cè)到病毒復(fù)制，在感染后第7天病毒滴度達(dá)到峰值(102.58TCID50/mL)(圖5)。

Th005和Th005 C組雞咽拭子能夠持續(xù)檢測(cè)到病毒復(fù)制，病毒滴度持續(xù)上升直至實(shí)驗(yàn)雞全部死亡，在感染后第4天和第3天病毒滴度到達(dá)最高值，分別為104.33TCID50/mL和103.89TCID50/mL；雞肛拭子同樣能夠持續(xù)檢測(cè)到病毒復(fù)制，滴度持續(xù)上升至實(shí)驗(yàn)雞全部死亡，在感染后第4天和第3天到達(dá)峰值，分別為105TCID50/mL和 105.37TCID50/mL。同時(shí)，肛拭子的滴度峰值要高于咽拭子(圖5)。

3 討論

自2013年我國發(fā)現(xiàn)全球首例人感染H7N9禽流感病毒病例以來，該病毒持續(xù)流行于我國家禽中。在前4波流行中，一直對(duì)禽無致病性。然而，從2017年第5波流行開始，我國禽類養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)禽類死亡，并能從禽類體內(nèi)分離出H7N9禽流感病毒[2]。為了確認(rèn)第5波疫情中H7N9病毒對(duì)禽的致病力變化，我們選取第5波病毒分離株Th005代表株感染禽類，以第1波分離株Anhui株作為參比，比較其對(duì)禽的致病力的變化。

通過雞的靜脈致病指數(shù)IVPI測(cè)定可以看出：Anhui株為低致病性禽流感病毒株，Th005株為高致病性禽流感病毒株。Anhui株感染雞后沒有任何癥狀，但是Anhui株在雞體內(nèi)傳代后感染雞，在感染后2 ～ 9 d，肛拭子可以持續(xù)檢測(cè)到病毒滴度。這說明Anhui株在禽類循環(huán)中可能獲得了新的宿主嗜性，對(duì)禽類的致病性逐漸增強(qiáng)；并且通過泄殖腔持續(xù)向外界排毒，使H7N9增加了接觸其他宿主的機(jī)會(huì)，從而持續(xù)傳播。這為第1波疫情爆發(fā)后，持續(xù)出現(xiàn)5次疫情提供了依據(jù)。并且H7N9通過持續(xù)向外界排毒，進(jìn)而達(dá)到在禽類中的反復(fù)適應(yīng)，逐漸增強(qiáng)對(duì)禽類的致病力，這也能部分解釋疫情中H7N9為何可以從無致病性向高致病性的轉(zhuǎn)變。

注：感染后雞咽拭子中病毒滴度：(A)Th005組，(B)Anhui組，(C)Th005 C組，(D)Anhui C組；感染后雞肛拭子中病毒滴度：(E)Th005組，(F)Anhui組，(G)Th005 C組，(H)Anhui C組。圖5 Th005、Anhui及其傳代株滴鼻感染實(shí)驗(yàn)雞的咽、肛拭子病毒滴度Note. Viral titers in oropharyngeal swabs from chickens:(A)Th005,(B)Anhui,(C)Th005 C,(D)Anhui C; Viral titers in cloacal swabs from chickens:(E)Th005,(F)Anhui,(G)Th005 C,(H)Anhui C.Figure 5 Viral titers in oropharyngeal swabs and cloacal swabs of the Th005, Anhui, and their progeny infected chickens

Th005及其傳代株感染雞后，3 ～ 5 d內(nèi)全部死亡。另外，咽試子和肛拭子能夠分離出高的病毒滴度，并逐漸升高一直持續(xù)到病死，肛拭子的病毒滴度峰值高于咽拭子。結(jié)合Anhui感染雞的排毒情況，可以看出H7N9禽流感病毒感染禽類后泄殖腔為重要的病毒復(fù)制及排毒通道。Th005的傳代株較原始株相比，致病力基本不改變，均對(duì)雞呈現(xiàn)高致病性，說明Th005對(duì)禽類不但保持高致病能力，還可在禽類循環(huán)后依舊保持高致病能力，也說明了H7N9病毒依然具有在禽中持續(xù)流行并對(duì)禽類具有高致病力的能力，提示農(nóng)業(yè)部門應(yīng)對(duì)H7N9保持高度警惕并采取防范措施。

另外，筆者對(duì)Anhui、Th005及其傳代株測(cè)序結(jié)果分析：與Anhui株比較，Th005株在HA裂解位點(diǎn)有“-KRIA-”堿性氨基酸的插入，提示Th005株已具備高致病性禽流感的分子特征[6-7]，這很可能是H7N9病毒由低致病性轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧虏⌒缘闹匾?。Anhui C與Anhui比較，在HA節(jié)段上發(fā)生了N133D和N158-159D的雙突變，Pantin-Jackwood 等[8-9]認(rèn)為HA-N133D/N158-159D雙突變可以降低HA的熱穩(wěn)定性并且增加HA蛋白對(duì)禽類唾液酸受體的結(jié)合能力，這也從分子水平上證實(shí)了H7N9在禽間循環(huán)過程中逐漸獲得了宿主嗜性，這與我們實(shí)驗(yàn)中Anhui傳代株較原始株相比對(duì)雞的致病力增強(qiáng)的結(jié)果相吻合。