β-氨基丙腈誘導(dǎo)鼠夾層動脈瘤動物模型的建立

馬曉中，張韶鵬，王菁，姜楠，陳慶良*

(1. 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070； 2. 天津市胸科醫(yī)院心外科，天津市心血管病研究所，天津，300222； 3. 天津市胸科醫(yī)院病理科，天津 300222)

夾層動脈瘤(aortic dissecting aneurysm)是臨床上最為兇險的疾病之一，具有發(fā)病急促，進展迅猛，死亡率高等特點[1]，目前對于其發(fā)病機制的研究多停留在疾病的終末狀態(tài)。因此，探索符合人類流行病特點和病理特點的動物模型，對于研究疾病的啟動和發(fā)展等的病理過程和發(fā)病機制具有重要意義。對于夾層動脈瘤動物模型的探索，已有60余年的歷史，傳統(tǒng)的外科造模方法具有手術(shù)難度大、費用高昂等不足。近年來研究者發(fā)現(xiàn)β-氨基丙腈(BAPN)可抑制哺乳動物體內(nèi)賴氨酰氧化酶活性，從而導(dǎo)致大動脈壁彈力纖維和膠原纖維分離，進而發(fā)生主動脈壁擴張或夾層[2]。但不同研究之間具有較大差異[3-4]，且BAPN本身具有較大毒性[5]。本研究旨在探索BAPN誘導(dǎo)夾層動脈瘤動物模型的可靠性，尋求符合人類疾病特點的動物模型，為進一步研究夾層動脈瘤發(fā)病機制奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級4 ～ 5周齡雄性SD大鼠18只，體重(110.50 ± 2.51)g；SPF級3周齡雄性C57BL/6小鼠40只，體重(12.21 ± 0.51) g，均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心(許可證號分別為SD大鼠【SCXK (京) 2016-0006】、C57BL/6小鼠【SCXK(京)2014-0013】)。動物飼養(yǎng)于天津市環(huán)湖醫(yī)院(天津市神經(jīng)外科研究所)【SYXK(津)2018-0009】，飼養(yǎng)期間給予小鼠標準飼料，飼養(yǎng)環(huán)境房內(nèi)濕度恒定，溫度20 ～ 25℃。

1.1.2 試劑與儀器

β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，美國西格瑪-奧德里奇公司)，二甲苯、無水乙醇、95%乙醇(天津市贏達稀貴化學(xué)試劑廠)，蘇木色精分色液、伊紅染液、蘇木色精染液(北京世濟合力生物科技有限公司)，10%中性福爾馬林固定液(天津久圣醫(yī)療電子儀器有限公司)。

全自動脫水機(Peloris，Leica公司，德國)，生物組織包埋機(JBM-A型，久圣醫(yī)療電子儀器，天津)，切片機(RM2135，Leica公司，德國)，全自動染片機(ST5020，Leica公司，德國)，光學(xué)顯微鏡(BX50，Olympus公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

所有實驗動物在實驗房適應(yīng)3 ～ 4 d后開始實驗。18只4 ～ 5周齡SD大鼠，隨機分為3組，每組6只，分別記作SD-0.2(A組)、SD-0.4(B組)、SD-0.6(C組)。40只3周齡C57BL/6小鼠，隨機分為4組，每組10只，分別記作C57-0.2(D組)、C57-0.4(E組)、C57-0.6(F組)、C57-對照(對照組)。

1.2.2 模型制作

A組、B組、C組大鼠分別給予0.2%、0.4%、0.6% BAPN溶液，飼養(yǎng)7周。D組、E組、F組和對照組小鼠分別給予0.2%、0.4%、0.6% BAPN水溶液和蒸餾水作為飲用水，飼養(yǎng)4 ～ 6周。所有實驗動物均自由取食飲水，記錄鼠每日采水量，每周進行1次體重測量，直至動脈瘤破裂死亡或?qū)嶒灲Y(jié)束。

1.2.3 實驗操作

實驗期間死亡的動物及時進行解剖，分離大動脈。飼養(yǎng)期結(jié)束后，將存活的實驗動物腹腔注射過量戊巴比妥鈉(200 mg/kg)處死，進行解剖。自心臟至髂動脈分叉處，充分游離大動脈，游離心臟及雙腎，同時將異常的骨骼組織、肺、破裂的腸壁等臟器分離，將獲取的標本于10%中性福爾馬林固定液中固定24 h以上，制成4 μm石蠟切片，進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

收集天津市胸科醫(yī)院行孫氏手術(shù)的主動脈夾層患者的升主動脈標本10例，制成4 μm石蠟切片，進行蘇木素-伊紅染色，將夾層患者大動脈病理變化與實驗動物進行分析比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BAPN對鼠體重和采水量的影響

隨著給藥濃度的增加， C57BL/6小鼠和SD大鼠的藥物攝入量均明顯增加，采水量卻呈現(xiàn)出減少態(tài)勢，且體重增長趨勢減緩，其中SD大鼠的量效關(guān)系更為明顯(圖1)。

2.2 生存分析

如圖2所示，隨著給藥濃度的增加，SD大鼠和C57BL/6小鼠生存率均呈現(xiàn)下降的趨勢。A組、B組、C組4周生存率分別為83.3%、50.0%、43.3%；7周生存率分別為33.3%、16.7%、0。C57BL/6小鼠中，D組、E組、F組4周生存率分別為70.0%、80.0%、50.0%；7周生存率分別為50.0%、40.0%、40.0%。SD大鼠和C57BL/6小鼠4周生存率、7周生存率最低組均為0.6%BAPN組。A組7周生存率最高，為50.0%，E組與F組7周生存率均為40%。

圖1 C57BL/6小鼠和SD大鼠體重、采水量、BAPN攝入量情況Figure 1 Changes of body weight, water intake and BAPN intake in the SD rats and C57BL/6 mice

2.3 大動脈改變

A、B、C組給藥4周后，均無動脈瘤發(fā)生；給藥7周后，各組發(fā)生大動脈破裂或動脈瘤的數(shù)量分別為1只、2只、0只。 B組中共兩只發(fā)生動脈瘤，1只大鼠于飼養(yǎng)第6周因升主動脈破裂而死，破口位于升主動脈，另1只于第7周末飼養(yǎng)結(jié)束時處死，解剖提示慢性夾層動脈瘤(圖3)。其余大鼠，解剖后大動脈均未見明顯異常。

圖2 C57BL/6小鼠與SD大鼠生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of the SD rats and C57BL/6 mice

D、E、F組給藥4周動脈瘤發(fā)生率分別為10%、20%、20%，截止第7周實驗結(jié)束，各組實驗動物動脈瘤發(fā)生率分別為50%、70%、60%(表1)。實驗結(jié)束時，處死的實驗動物中，D組1只發(fā)生升主動脈瘤；E組中，1只為升主動脈瘤，2只為降主動脈瘤；F組中2只均為升主動脈瘤。

光鏡下可見實驗組大動脈中膜增厚，彈力纖維排列紊亂，伴大量紅細胞和淋巴細胞浸潤(圖4)。C57BL/6小鼠中，實驗組升主動脈直徑和中膜面積均呈現(xiàn)增長趨勢(圖5)。對照組升主動脈直徑為(0.96 ± 0.07)mm，中膜面積為(0.19 ± 0.02)mm2；D組升主動脈直徑、中膜面積分別為(0.98 ± 0.22)mm、(0.27 ± 0.12)mm2；E組升主動脈直徑、中膜面積分別為(0.99 ± 0.11)mm、(0.23 ± 0.11)mm2；F組升主動脈直徑、中膜面積分別為(1.02 ± 0.08)mm、(0.31 ± 0.09)mm2。

表1 夾層動脈瘤發(fā)生率(%)Table 1 Incidence rate of aortic aneurysm

注：箭頭所示為破口或動脈瘤形成病理切片可見夾層形成。(100×)圖3 夾層動脈瘤大體標本和病理切片改變Note. Yellow arrow indicated the location of aneurysm. Dissection formation was showed in histology. (100×)Figure 3 Macroscopic and histopathological features of the dissecting aneurysm

2.4 其他臟器改變

C57BL/6小鼠組，E組中1只小鼠發(fā)生脊柱測彎，1只小鼠死亡后解剖提示于大量胸腔積液，肺葉壓縮萎陷，呈白色。其余C57BL/6小鼠解剖均未見明顯臟器異常(除外大動脈破裂或擴張)。

SD大鼠組，A組中3只SD大鼠發(fā)生腸破裂，B組中有2只SD大鼠發(fā)生腸破裂，C組中4只SD大鼠發(fā)生腸破裂(表2)。發(fā)生腸破裂的大鼠，均自直腸發(fā)生腸梗阻，降結(jié)腸處發(fā)生破裂，致嚴重腹膜炎，空回腸嚴重腸脹氣。解剖可見脊柱側(cè)彎，脊柱旁或肋骨近肋脊關(guān)節(jié)出可見瘤樣膨出，呈白色，質(zhì)地稍硬(圖6)，光鏡下顯示鈣鹽沉積，可見異形的腫瘤細胞。心肌和結(jié)腸肌層均可見不同程度的淋巴細胞浸潤(圖7)。

2.5 夾層動脈瘤患者大動脈病理改變

人急性主動脈夾層大動脈病理改變主要體現(xiàn)為：囊性中膜壞死、平滑肌細胞排列紊亂及彈力纖維斷裂。其中，平滑肌細胞的形態(tài)學(xué)改變(變性壞死、排列紊亂及重塑)被認為是發(fā)生夾層動脈瘤的重要因素[6-7]。夾層動脈瘤患者平滑肌變性壞死重于平滑肌重塑、基質(zhì)降解、基質(zhì)黏液樣變性等(圖8)。

注：可見實驗組大動脈中膜增厚明顯，彈力纖維出現(xiàn)斷裂、排列紊亂等改變，并有大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞為主。(100×)圖4 各組升主動脈病理改變Note. Increased thickness of the tunica media, disruption and disarrangement of elastic fibers, and inflammatory cell infiltration and many multi-nucleate giant cells are present in the aortic tissues. (100×)Figure 4 Pathological changes of the ascending aortas

注： 與對照組相比，實驗組升主動脈直徑和中膜面積均呈現(xiàn)增長趨勢(P< 0.05)。圖5 C57BL/6各組小鼠升主動脈直徑及中膜面積變化Note. Compared with the control group, both diameter and area of tunica media showed a rising tendency (P< 0.05).Figure 5 Changes of the diameter and area of tunica media of the mouse ascending aortas

組別GroupsSD大鼠(%) SD rats (%) C57BL/6小鼠(%) C57BL/6 mice (%)腸破裂Colon rupture骨骼畸形Scoliosis胸腔積液Hydrothorax腸破裂Colon rupture骨骼畸形Scoliosis胸腔積液Hydrothorax0.2%50(3/6)0(0/6)0(0/6)0(0/10)0(0/10)0(0/10)0.4%33(2/6)33(2/6)0(0/6)0(0/10)10(1/10)10(1/10)0.6%66(4/6)33(2/6)0(0/6)0(0/10)0(0/10)0(0/10)

注.黃色箭頭所示為發(fā)生脊柱側(cè)彎、肋骨腫物、腸破裂部位。圖6 骨骼、結(jié)腸大體標本Note. Yellow arrows indicated the sites of scoliosis, rib fracture and colon rupture.Figure 6 Macroscopic changes of the skeleton and colon

注： 心臟：心外膜下心肌細胞排列疏松，伴單核淋巴細胞浸潤。結(jié)腸：結(jié)腸肌層分離，大量紅細胞和淋巴細胞浸潤。肋骨腫物：鈣鹽沉積，可見異形的腫瘤細胞。(100×)圖7 心臟、結(jié)腸和肋骨的病理改變Note. Heart, Loose arrangement of cardiomyocytes accompanied by lymphocyte and mononuclear cell infiltration. Colon, The muscle layer was dissected, and accumulation of great amount of erythrocytes and lymphocyte infiltration. Rib, calcium deposition and heteromorphic tumor cells. (100×)Figure 7 Histological changes of the heart, colon and rib

注：A-D為急性A型主動脈夾層患者，其中D為醫(yī)源性主動脈夾層。A、C、D：中膜分離，夾層形成并可見紅細胞及炎性細胞浸潤。B：中膜平滑肌細胞變性、壞死，彈力纖維斷裂、排列紊亂，基質(zhì)粘液樣變性。(100×)圖8 夾層動脈瘤患者升主動脈病理切片Note. A-D. Ascending aorta from a patient with acute aortic dissecting aneurysm. D. Iatrogenic aortic dissection. A, C, D. Separation of the tunica media, with erythrocyte accumulation and inflammatory cell infiltration. B. Necrosis and degeneration of smooth muscle cells, destruction and disarrangement of elastic fibers in the tunica media, and mucoid degeneration of matrix. (100×)Figure 8 Histological changes in the human aortic tissues

3 討論

3.1 BAPN對鼠大動脈影響

賴胺酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)是一種具有銅結(jié)合位點的單胺氧化酶[5, 8]，相對分子質(zhì)量為32 000，能夠氧化膠原和彈性蛋白的賴氨酸殘基，使這些纖維性蛋白的共價交聯(lián)，從而形成穩(wěn)定的細胞外基質(zhì)。BAPN是不可逆性LOX抑制劑，能競爭性地與彈性蛋白或氨基烷基結(jié)合，從而抑制彈性蛋白和膠原蛋白的交聯(lián)[2]。

BAPN處理剛離乳的幼鼠可致其大動脈中模增厚，彈力纖維、膠原蛋白等細胞外基質(zhì)發(fā)生排列紊亂、壞死等病理改變，與夾層患者大動脈病理改變基本相符。3周齡幼鼠處于快速生長發(fā)育階段，BAPN可抑制大動脈細胞外基質(zhì)成分的形成，從而導(dǎo)致動脈瘤或動脈夾層的形成。其作用有明顯的種屬差異，且與發(fā)育程度密切相關(guān)[3]。Ren等[3]證實，F(xiàn)VB小鼠動脈瘤成模率遠低于C57BL/6小鼠。本研究前期實驗曾采用6周齡雄性C57BL/6小鼠，BAPN飼養(yǎng)6周未見大動脈異常改變。而4 ～ 5周齡SD大鼠模型成功率低、死亡率高可能與周齡過大，生長發(fā)育趨于成熟有關(guān)。

3.2 BAPN對其他臟器影響

本研究中E組(C57-0.4%)，尸檢可見1只小鼠發(fā)生脊柱側(cè)彎，1只小鼠存在大量胸腔積液，未見明顯其他異常；SD大鼠組，腸破裂和肋骨腫物的發(fā)生率遠高于夾層動脈瘤發(fā)生率，而類似的情況在其他動物模型研究中鮮有報道。

在哺乳動物體內(nèi)，賴胺酰氧化酶家族包括5種[2, 5]，每一種酶由不同的基因編碼：lysyl oxidase (LOX) 和 lysyl oxidase-like 1-4 (LOXL1 - LOXL4)。每一種LOX，其個體發(fā)育受特定組織或細胞的特異性表達和定位的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致LOX的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生的復(fù)雜變化[2, 9]。LOX功能非常廣泛,除了保持細胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定外，還能夠抑制Ras癌基因誘導(dǎo)的細胞表型的轉(zhuǎn)變，以及抑制腫瘤的形成[10]，對維持細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的正常、組織器官的發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)甚至腫瘤的轉(zhuǎn)移都具有重要的意義[11]。BAPN可以通過修飾膠原蛋白導(dǎo)致心肌異常[12]；在結(jié)直腸、膀胱、食管、頭頸部等組織發(fā)生的惡性腫瘤中，LOX家族相關(guān)蛋白表達明顯增加，表現(xiàn)為促腫瘤轉(zhuǎn)移作用[13]。Kubota等[14]的一項研究中，在雞胚孵化的49天，注入BAPN，發(fā)現(xiàn)多發(fā)骨骼畸形，特別是脛跗骨的畸形更為明顯。

基于BAPN作用機制及其他研究報道，可以認為該試劑可對全身富含彈性蛋白和膠原蛋白的結(jié)締組織產(chǎn)生各種負面作用。盡管BAPN用于夾層動脈瘤動物模型有較高的成功率，由于上述種種作用，該試劑造模過程中，不可避免地會發(fā)生因其他系統(tǒng)嚴重功能障礙而導(dǎo)致的死亡(如SD大鼠中發(fā)生率較高的腸破裂)，模型過高的死亡率勢必會影響該模型應(yīng)用于下一階段的研究。

3.3 模型成功率與BAPN量效關(guān)系

本研究中，C57-0.4組夾層動脈瘤發(fā)生率最高為70%(7/10)，采用0.4%的給藥濃度，BAPN攝入量為0.6 g/(kg·d)。高艷香等[4]用同樣的方式成功建立了小鼠夾層動脈瘤動物模型，其實驗結(jié)果顯示，夾層動脈瘤的發(fā)生對BAPN存在明顯的計量依賴性，而Ren等[3]實驗結(jié)果則截然相反，本實驗同樣不支持模型成功率與攝入量存在明顯正相關(guān)系。事實上，無論將BAPN混入飼料或是飲用水中，特定給藥濃度下，動物攝入飼料或水的量難以準確計量。因此，BAPN實際攝入量均存在較大誤差，現(xiàn)有的實驗方案尚需大量重復(fù)實驗來驗證其穩(wěn)定性。

3.4 該動物模型不足之處

1)實驗周期較長，大部分動物模型實驗周期均以4周為限，而本實驗4周成模率極低；2)本實驗未采用其他特殊染色方法，無法進行彈性蛋白、膠原蛋白等定性、定量分析；3)實驗進行中隨著動物的死亡，存活動物的體重、采水量等計量資料不符合正態(tài)分布，未進行有效的差異性檢驗；4)實驗動物數(shù)量相對較少，實驗方案未進行重復(fù)性實驗。

因種屬差異性等原因，任何動物模型均不能完全代表人類疾病，研究者需根據(jù)實驗需求來選擇合理的動物模型。研究保護因素，可選用成模率較高的動物模型，研究危險因素則與之相反[4]。

4 結(jié)論

C57BL/6小鼠夾層動脈瘤動物模型的病理改變與夾層動脈瘤患者基本符合，選用0.4%濃度的BAPN溶液作為飲用水造模，可作為一種簡便、經(jīng)濟、有效的動物模型進行下一步研究。然而，SD大鼠發(fā)生腸破裂、脊柱側(cè)彎等致死性并發(fā)癥比例高于夾層動脈瘤發(fā)生率，其作為夾層動脈瘤動物模型尚需進一步探索。