人參皂苷Rh2免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展

黃容容 錢 穎 向 明

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生物藥學(xué)系，武漢 430030)

人參皂苷Rh2是一種四環(huán)三萜類皂苷單體，按結(jié)構(gòu)分類屬于二醇型人參皂苷(Protopanaxadiol，PPD)，是人參中的稀有皂苷[1]。Rh2最早發(fā)現(xiàn)于紅參中，后來亦在西洋參、三七等多種中藥中分離得到[2]，目前Rh2的獲取方法有提取分離法、酸處理轉(zhuǎn)化法和生物轉(zhuǎn)化法[3,4]，這些技術(shù)為Rh2的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。藥理學(xué)研究表明Rh2對免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均有調(diào)節(jié)作用，具有抗腫瘤、抗過敏、抗抑郁、抗衰老及改善心肌缺血等功效[5,6]。由于免疫系統(tǒng)在許多人類疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色，因此Rh2的免疫調(diào)節(jié)活性研究及其在防治免疫性疾病中的應(yīng)用價值引起人們的關(guān)注。在抗腫瘤方面，Rh2不但可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯腫瘤細(xì)胞周期等機制抑制多種腫瘤的發(fā)展[7,8]，還可以增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答、改善化療藥的免疫抑制作用[9]。Rh2還有顯著的抗炎作用，可以抑制細(xì)菌內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并對阿爾茲海默癥、過敏性哮喘、過敏性皮炎等具有潛在治療作用[10,11]。本文就Rh2在免疫調(diào)節(jié)方面的作用作如下綜述。

1 Rh2對腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用

目前Rh2腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用的研究主要集中于對腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞功能及細(xì)胞因子分泌的影響，表現(xiàn)為促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤周圍M2型巨噬細(xì)胞向M1型分化，增強NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子分泌等。

1.1Rh2增強腫瘤環(huán)境中效應(yīng)性T細(xì)胞活性 免疫反應(yīng)是機體對抗腫瘤的基本途徑，效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)中具有抗腫瘤作用的最主要的效應(yīng)細(xì)胞之一，分為CD4+輔助性T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。CD4+輔助性T細(xì)胞通過促進(jìn)B細(xì)胞活化、激活NK細(xì)胞等殺傷腫瘤細(xì)胞，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)通過分泌能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解或凋亡的穿孔素/顆粒酶、TNF-α、IFN-γ等直接或間接發(fā)揮抗腫瘤作用[12，13]。

研究發(fā)現(xiàn)Rh2可以促進(jìn)黑色素瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤，增加腫瘤周圍T細(xì)胞數(shù)量；同時該研究的非放射性細(xì)胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)與模型組小鼠相比，Rh2處理組小鼠T細(xì)胞具有較高的殺傷活性，提示Rh2提高腫瘤周圍T細(xì)胞數(shù)量的同時還能增強T細(xì)胞活性[14]。Rh2及其主要代謝產(chǎn)物R-PHQ和S-PHQ上調(diào)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能低下小鼠的免疫應(yīng)答：Rh2阻止荷瘤小鼠免疫器官萎縮，促進(jìn)ConA刺激的脾細(xì)胞增殖，恢復(fù)CD4+/CD8+T比例，并抑制CD4+CD25+T細(xì)胞水平[15]。臨床研究表明Rg3可以上調(diào)鼻咽癌放療患者的CD4+T/CD8+T細(xì)胞比例，Rh2是Rg3體內(nèi)降解的主要活性產(chǎn)物，這提示Rh2也可能增加鼻咽癌患者的CD4+T、CD8+T細(xì)胞[16]。另外，Rh2的硫酸化修飾產(chǎn)物Rh2-B1激活CD8+T細(xì)胞株CTLL-2中p38MAPK和ERK依賴的信號通路并抑制p56 Lck和STAT5蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)CTL-2細(xì)胞增殖和IFN-γ的分泌，增強抗腫瘤免疫應(yīng)答[17]。

1.2Rh2調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型及活性 巨噬細(xì)胞是非特異性免疫防御的重要成員，具有吞噬、遞呈抗原，調(diào)控局部組織微環(huán)境等多種功能，按作用及所處環(huán)境不同可分為M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macroph-ages，TAMs)等[18，19]。TAMs存在于腫瘤組織中，在腫瘤微環(huán)境下TAMs向M2型極化促進(jìn)腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，M1型巨噬細(xì)胞可通過分泌活性氧和氮中間體來殺死腫瘤細(xì)胞，同時分泌TNF-α和IL-1β招募CTL來攻擊腫瘤細(xì)胞[20]，研究表明逆轉(zhuǎn)腫瘤組織TAMs向M1極化，有助于抑制腫瘤生長[21]。

Li等[22]報道，Rh2通過調(diào)節(jié)TAMs與非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)之間的相互作用阻止腫瘤遷移和侵襲，用Rh2處理TAMs與NSCLC共培養(yǎng)的細(xì)胞系A(chǔ)549、H129，發(fā)現(xiàn)Rh2減少M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206分子和血管內(nèi)皮生長因子VEGF，增加M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD16/32分子，同時減少NSCLC中基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)MMP2和MMP9。除了Rh2外，另有研究報道參芪扶正注射液也有促進(jìn)TAMs向M1型極化的作用[23]。Rh2還可以增強環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬能力，H22荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和碳清除率測試結(jié)果顯示，與環(huán)磷酰胺組比較，Rh2及其代謝物R-PHQ和S-PHQ預(yù)處理組增強腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬功能和碳清除指數(shù)[15]。

1.3Rh2增強腫瘤周圍NK細(xì)胞毒性 NK細(xì)胞是一種非特異性免疫細(xì)胞，其抗腫瘤方式包括直接殺傷腫瘤細(xì)胞和介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷腫瘤：一方面，NK細(xì)胞識別靶細(xì)胞后釋放顆粒酶B和穿孔素，穿孔素在腫瘤細(xì)胞膜上形成“孔道”使水、電解質(zhì)和顆粒酶B進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面，激活的NK細(xì)胞促進(jìn)DC成熟，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞極化并提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷活性，從而介導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫[24，25]。文獻(xiàn)報道人參總皂苷能提高肝臟腫瘤組織中浸潤NK1.1+細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)NK細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B釋放，從而增強對腫瘤的殺傷作用[26]。H22荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性處于嚴(yán)重低下狀態(tài)，而人參皂苷Rh2干預(yù)處理明顯增強NK細(xì)胞殺傷活性[27]。從健康女性的外周血中分離出NK細(xì)胞，用二醇型人參皂苷PPD處理，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞群(NKG2A)的受體NKp30、NKp46增加，IFN-γ產(chǎn)生增加，IL-10表達(dá)降低[28]。

1.4Rh2調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子分泌 腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子極為復(fù)雜，按功能不同分為兩大類：一類是促炎癥細(xì)胞因子，包括IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ、TNF-α等；另一類是抑炎癥因子，包括IL-10、IL-13和TGF-β等[29]。促炎癥細(xì)胞因子由T細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α在抑制腫瘤生長過程中起著重要作用：IFN-γ主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，能激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)從而殺傷腫瘤細(xì)胞[30]；TNF-α由巨噬細(xì)胞、腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤凋亡[31]。抑炎癥因子由Treg、M2型巨噬細(xì)胞、髓系抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)等免疫抑制細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制免疫和促進(jìn)腫瘤生長的作用：例如IL-10、IL-6、TGF-β抑制DC成熟，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞及NK細(xì)胞活化，同時誘導(dǎo)MDSCs增殖，造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[32]。

有研究報道Rh2有效抑制人白血病細(xì)胞HL-60和多種腫瘤細(xì)胞如K562、A549和MCF7的生長增殖，微陣列分析發(fā)現(xiàn)Rh2明顯上調(diào)HL-60的TNF-α表達(dá)，抗TNF-α抗體減弱了Rh2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示Rh2通過TNF-α信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33]。Wang等[34]報道Rh2上調(diào)結(jié)腸癌小鼠血清中IL-6、IL-18、TNF-α的分泌水平，緩解腫瘤相關(guān)的免疫抑制現(xiàn)象，延長結(jié)腸癌小鼠的生存期。Han等[35]報道20(S)-Rh2通過抑制JAK2/STAT3通路和MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲，IL-6刺激HCT116細(xì)胞顯著增加JAK2的酪氨酸磷酸化，20(S)-Rh2處理則抑制這種磷酸化，表明Rh2能抑制炎癥環(huán)境下的腫瘤生長[35]。

2 Rh2治療炎癥相關(guān)免疫性疾病

炎癥是機體自身的防御反應(yīng)，適度炎癥有利于機體抵御感染、異物入侵、清除損傷組織等，但過度炎癥則會導(dǎo)致組織損傷和多種疾病的發(fā)生，即造成炎癥相關(guān)免疫性疾病，例如變態(tài)反應(yīng)、阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease，AD)等，異常嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致器官衰竭。研究發(fā)現(xiàn)Rh2具有抗炎作用，對AD、變態(tài)反應(yīng)等炎癥相關(guān)免疫性疾病有治療作用。

2.1Rh2抑制細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng) 巨噬細(xì)胞既是機體重要的固有免疫細(xì)胞，又是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞之一。LPS通過巨噬細(xì)胞表面TLR4受體激活細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，引起巨噬細(xì)胞中iNOS、COX-2的高表達(dá)和NF-κB信號通路的活化，炎癥蛋白和PGE2過量產(chǎn)生，促炎癥細(xì)胞因子NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等大量分泌[36，37]，進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞并釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子，這些免疫細(xì)胞及炎性因子過度堆積造成組織炎癥及免疫疾病的發(fā)生。而抑炎因子IL-10和TGF-β能夠抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低LPS造成的炎癥反應(yīng)和組織損傷。

據(jù)報道富含人參皂苷Rh2的人參根部水提物可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放活性氧(ROS)[38]，推測Rh2對細(xì)菌內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。而另外幾項研究報道證實了上述的推測，其中Bi等[39]報道增加水溶性基團(tuán)修飾后的Rh2-B2顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，同時增加IL-10的產(chǎn)生，其作用機制是Rh2-B2顯著抑制p38 MAPK和c-Jun N末端激酶的磷酸化以及NF-κB入核，通過阻斷絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB信號通路抑制由LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥[40]。除此之外，Rh2能夠抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中PGE2、ROS和原基質(zhì)金屬蛋白酶-9(pro-MMP-9)的產(chǎn)生，以及抑制人HaCat角化細(xì)胞ROS水平和MMP-9、MMP-2活性，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的MMP-9明膠酶活性[41]。由于LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與感染性或部分自身免疫性疾病(例如炎癥性腸病)的病理進(jìn)程，因此Rh2的抗炎功效提示其可能在防治該類疾病上具有一定的作用。

2.2Rh2對AD的治療作用 AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，特征性病理改變?yōu)榧?xì)胞外β淀粉樣蛋白沉積、細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)以及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化造成神經(jīng)元損傷[42]。Aβ纖維能夠誘發(fā)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，激活的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放毒性產(chǎn)物，包括前炎性因子、氧自由基、蛋白激酶、化學(xué)趨化因子和興奮性毒素等，損傷周圍神經(jīng)元，從而引起神經(jīng)元凋亡，突觸丟失，進(jìn)而發(fā)生神經(jīng)退行性改變[43，44]。AD患者腦內(nèi)老年斑周圍大量活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB增高，引起多種炎性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使炎癥細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β和NO等產(chǎn)生[45]；同時，環(huán)氧合酶COX1/2也參與了小神經(jīng)細(xì)胞活化和PGs合成，對神經(jīng)細(xì)胞造成炎性損傷[46]?？傊?，AD成因眾多，免疫系統(tǒng)進(jìn)行性衰竭和慢性炎癥是重要的誘因及病理變化。

Qiu等[47]通過原代神經(jīng)細(xì)胞和Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)實驗證明Rh2能調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白APP內(nèi)吞作用，減少腦內(nèi)Aβ積聚，改善Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。Kumar等[48]報道Rh2可抑制LPS引起的炎癥反應(yīng)及小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)毒性，顯著增加小膠質(zhì)細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)，降低NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和iNOS的生成，有效地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改善神經(jīng)變性。Hou等[49]報道Rh2能顯著降低三甲基錫(Trimethyltin，TMT)誘導(dǎo)的小鼠癲癇發(fā)作頻率，同時Rh2處理能減少TMT誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡及炎癥細(xì)胞因子IL-1α/β、IL-6、TNF-α、MCP-1的活化，保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞并減少氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，其作用機制是選擇性上調(diào)PI3K/AKT通路和抑制ERK活化。

2.3Rh2對變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療作用 變態(tài)反應(yīng)是機體受到抗原刺激引起組織損傷或功能紊亂的病理性免疫反應(yīng)，常發(fā)生于呼吸道、皮膚、消化道等部位，引發(fā)哮喘、過敏性皮炎、過敏性鼻炎、濕疹等疾病。過敏性哮喘是一種慢性炎癥疾病，發(fā)病機制是過敏原與它們的互補免疫球蛋白IgE結(jié)合，激活I(lǐng)gE受體肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，致使Th1/Th2型細(xì)胞失衡，Th2細(xì)胞分化增加，炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等產(chǎn)生增多[50，51]，進(jìn)一步導(dǎo)致肺內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞浸潤[52]，在該過程中NF-κB參與Th2細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[53，54]。過敏性皮炎是由過敏源引起的皮膚炎癥，發(fā)病過程與過敏性哮喘類似，該過程有NF-κB/STAT6信號通路的參與[55，56]。

在過敏性哮喘小鼠模型中，Rh2減輕氣道炎癥反應(yīng)，降低總卵清蛋白特異性IgE水平以及肺組織和肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13蛋白水平，增加IFN-γ蛋白水平，其分子機制是阻止小鼠肺組織IκB-α的磷酸化降解和NF-κBp65易位入核，抑制MAPKp38磷酸化，從而抑制炎癥，緩解哮喘[57，58]。有報道Rh2抑制過敏性炎癥：在小鼠接觸性皮炎模型中，Rh2有效抑制耳腫脹，降低小鼠耳朵組織中COX-2、IL-1β、IL-4、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平，表現(xiàn)出抗炎和治療過敏性皮炎的活性[59]。此外，Rh2可治療LPS誘導(dǎo)的動物急性肺損傷，通過阻斷iNOS、COX-2、IκB-α、ERK、JNK、p38MAPK、Raf-1和MEK蛋白的磷酸化，降低促炎介質(zhì)NO、TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[60]。人參皂苷Rg3也可治療小鼠急性肺損傷，顯著抑制小鼠體內(nèi)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，同時防止抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的減少，降低肺部炎癥[61]。

3 總結(jié)與展望

目前研究表明人參皂苷Rh2具有調(diào)節(jié)腫瘤免疫及治療炎癥相關(guān)免疫性疾病的活性或潛能。值得注意的是，Rh2在不同疾病背景中對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用不盡相同：在腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致的免疫抑制情況下，Rh2提高CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例，通過p38 MAPK通路激活CTL細(xì)胞并使其INF-γ產(chǎn)生量增加，Rh2作用于VEGF分子促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化，產(chǎn)生TNF-α、INF-γ、IL-6等正向免疫因子，提高機體免疫應(yīng)答；然而在炎癥、AD、變態(tài)反應(yīng)等免疫亢進(jìn)情況下，Rh2通過COX1/2、NF-κB、p38 MAPK/JNK 和PI3K/AKT等信號通路抑制NO、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平，同時增加抗炎因子IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，抑制機體免疫亢進(jìn)。關(guān)于Rh2在腫瘤免疫和炎癥相關(guān)免疫性疾病中對免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)情況不同的疑問，根據(jù)現(xiàn)有資料推測這可能與不同疾病背景下Rh2對不同免疫細(xì)胞群具有選擇性調(diào)節(jié)作用有關(guān)，具體原因有待探討。

Rh2的免疫調(diào)節(jié)功能雖然得到了大量體內(nèi)外實驗數(shù)據(jù)的支持，但是其作用靶點及具體機制仍未得到完全闡釋：一方面Rh2調(diào)節(jié)腫瘤免疫的分子機制(如調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化)有待進(jìn)一步深入研究；另一方面Rh2具有的抗炎作用，提示其可能對感染性、慢性炎癥性疾病(如2型糖尿病)及急性肺損傷等炎癥相關(guān)免疫性疾病有防治作用，療效尚需驗證。此外，目前Rh2增強腫瘤免疫的藥效學(xué)研究主要處于動物實驗階段，臨床研究有待加強，以拓展其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。