人心果不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

吳濤 張慧賢 張方州 鄭中兵

摘 要 以人心果果實(shí)為研究材料，以水、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯和石油醚共計(jì)5種溶劑對(duì)人心果果實(shí)部位進(jìn)行提取，對(duì)5種提取劑提取的樣液分別進(jìn)行DPPH自由基清除活性、鐵離子還原能力（FRAP）、ABTS自由基清除活性及總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，使用不同溶劑的人心果提取樣液測(cè)定結(jié)果中存有一定的差別，樣液抗氧化活性由高到低的排序?yàn)椋?0%乙醇>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚;此外，研究結(jié)果顯示，人心果的抗氧化活性與總黃酮含量存在較好的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 人心果;提取劑;總黃酮;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.27.066

人心果（Manilkara zapota）是山欖科人心果屬[1]，原產(chǎn)地在美洲熱帶，后又引種到印度和東南亞等地，我國(guó)人心果是由華僑從東南亞引種而來(lái)[2-3]。果樹屬于常綠喬木，具有白色乳汁，因其樹形美姿常用于觀賞領(lǐng)域;果實(shí)為漿果，成熟時(shí)呈灰褐色或銹褐色，果肉呈現(xiàn)黃褐色透明狀，果皮和果肉不易分離，有核[4-5]。人心果中含有大量的有益物質(zhì)，何鋼等[6]發(fā)現(xiàn)人心果乳汁中具有多種對(duì)人體有益的化學(xué)成分，可進(jìn)一步開發(fā)，作為多應(yīng)用領(lǐng)域的植物。李安平等[7]發(fā)現(xiàn)人心果對(duì)于·OH、ABTS+、DPPH·的清除作用較好。張秀梅等[8]在人心果葉的研究中發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力較好。馬飛躍等[9]在研究人心果葉片時(shí)發(fā)現(xiàn)，葉片中含有較高的抗氧化成分，同時(shí)采用多種方法測(cè)定人心果葉片抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)結(jié)果存在差別。在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定水果抗氧化能力時(shí)，提取劑的選擇較為單一，類似研究也較為少見。然而想要全面客觀地反映某種水果的抗氧化活性必須設(shè)定在不同的反應(yīng)條件中進(jìn)行比較[10]，溶解水果成分的提取劑環(huán)境便是一個(gè)重要影響因素。

由于近年對(duì)人心果果實(shí)的研究相對(duì)較少，因此本研究選擇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的熱帶名優(yōu)水果——人心果。研究選取了甲醇、70%乙醇、水、乙酸乙酯和石油醚這5種較為常見的溶劑對(duì)人心果進(jìn)行提取，并通過(guò)DPPH法、FRAP法、ABTS法分析樣液的抗氧化能力。3種抗氧化測(cè)定方法在國(guó)內(nèi)食品抗氧化能力測(cè)定中很常見，且比較方便。此外，研究測(cè)定了人心果的總黃酮含量，并分析了其與抗氧化能力之間的相關(guān)性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人心果購(gòu)自?？谀媳彼袌?chǎng)，經(jīng)檢查確定新鮮且無(wú)病蟲害。

1.2 試劑

甲醇、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、水溶性維生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）、Folin-Ciocalteu、蘆丁。

1.3 儀器

KF10920單道可調(diào)移液槍、KD12283單道可調(diào)移液槍、AS220.R1萬(wàn)分之一電子分析天平、粉碎機(jī)、T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)、DHG-9053A干燥箱、HH-4A數(shù)顯恒溫水浴鍋、DW100實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)、KQ5200E型超聲波清洗機(jī)、TGL-16S臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

2 方法

2.1 樣液的提取

2.1.1 樣品的制備

將人心果洗凈后去皮切成片，放置在烘干箱中烘干，溫度為70 ℃，烘干時(shí)間約4 d。期間要保證烘干箱保持該狀態(tài)，切忌斷電。4 d后用粉碎機(jī)粉碎5 min，若仍存在顆粒大的樣品，可增加時(shí)長(zhǎng)，或者用研缽將大顆粒研磨成粉末狀，在室溫下用保鮮袋保存。

2.1.2 稱量

使用分析天平稱取3組0.100 0 g樣品，并置于5 mL離心管中，標(biāo)記序號(hào)。

2.1.3 樣液制備

使用無(wú)水乙醇配制70%乙醇，用移液槍吸取4 mL，加入離心管并充分振蕩。為了使水果的溶解更加充分徹底，將樣品進(jìn)行超聲處理。超聲處理結(jié)束后將離心管擦拭干后離心，離心前要對(duì)每組進(jìn)行稱量配平，達(dá)到每組盛有樣液的離心管質(zhì)量一致的標(biāo)準(zhǔn)。配平后放入離心機(jī)，35 ℃條件下，5 000 r·min-1離心7 min。離心結(jié)束后，小心取出離心管，避免振蕩，將每個(gè)離心管上清液取出，按順序置于相應(yīng)的10 mL離心管中。為了使樣品提取更加充分，向已提取上清液的5 mL離心管中加入3 mL70%乙醇，充分振蕩每個(gè)離心管后，進(jìn)行第2次超聲離心，離心后合并兩次上清液并冷藏保存。用等體積蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚代替70%乙醇溶液按照同樣的操作步驟進(jìn)行樣液制備。

2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

依據(jù)Thaipong等[11]的方法，以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，做適當(dāng)改進(jìn)。取重量為0.062 6 g的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，使用70%乙醇溶液定容至25 mL，配制成濃度為10 mmol·L-1的Trolox乙醇溶液作為該實(shí)驗(yàn)的母液。將母液按照表1進(jìn)行濃度稀釋并編號(hào)。將標(biāo)準(zhǔn)溶液與2 mLDPPH甲醇溶液混合，充分搖勻后置入暗箱中，20 min后于517 nm處測(cè)量吸光值，用蒸餾水作對(duì)照，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=-7 978x+2 738.7，R?=0.975 3）。

取25 μL樣品提取液，按照以上步驟反應(yīng)，于同等條件下測(cè)定不同提取液的DPPH自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測(cè)定測(cè)定物質(zhì)中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.3 FRAP法測(cè)定抗氧化能力

按照“2.2”配制Trolox母液并稀釋編號(hào)。取1 mL蒸餾水與10 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液混合稀釋，搖勻后在體系中加入1.8 mL TPTZ溶液，混勻后在37 ℃反應(yīng)10 min后于593 nm處測(cè)量吸光光度值，結(jié)果如表2所示，用蒸餾水作對(duì)照，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=5 043x-457.59，R?=0.989 7）。

取10 μL樣品提取液，按照以上步驟反應(yīng)，在相同條件下測(cè)定3個(gè)提取液的鐵離子還原能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測(cè)定物質(zhì)中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.4 ABTS自由基清除能力測(cè)定

依據(jù)于靖[12]的方法，配制Trolox母液并稀釋編號(hào)。取5 mLABTS溶液（7 mmol·L-1）和88 μL K2S2O8水溶液（140 mmol·L-1），避光反應(yīng)12 h后于732 nm處測(cè)量吸光光度值，結(jié)果如表3所示，用蒸餾水作對(duì)照，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=-4 730.9x+3 210.4，R?=0.988 8）。

取25 μL樣品提取液，按照以上步驟反應(yīng)，于同等條件下測(cè)定3個(gè)提取液的ABTS自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測(cè)定物質(zhì)中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.5 總黃酮測(cè)定

參照李洪芹[13]的總黃酮提取方法并加以改進(jìn)，按照下表配制不同濃度蘆丁。取1 mL蘆丁溶液與0.15 mL的5% NaNO2混合，反應(yīng)6 min;反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)加入0.15 mL的10% AlCl3，反應(yīng)6 min;再向體系中加入2 mL 4% NaOH及5 mL蒸餾水，反應(yīng)15 min。在420 nm處測(cè)定吸光值，結(jié)果如表4所示，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.920 3x-0.000 1，R2=0.998 7）。

取1 mL樣液，按照以上步驟反應(yīng)，于同等條件下測(cè)定3個(gè)提取液中的總黃酮含量，結(jié)果以蘆丁等價(jià)值g/100 g-1表示。

2.6 數(shù)據(jù)分析方法

采用IBM SPSS Statistics V21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平為0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 DPPH自由基清除能力

如圖1所示，人心果果實(shí)樣提取液具有一定的DPPH自由基清除能力，不同組別存在一定的差異。在清除能力上，乙酸乙酯提取液的抗氧化活性強(qiáng)度高于其余4種，水、石油醚、70%乙醇提取液測(cè)得的結(jié)果活性強(qiáng)度一般，甲醇測(cè)得的人心果抗氧化活性強(qiáng)度最差。

3.2 還原抗氧化能力（FRAP）

如圖2所示，在人心果的FRAP法測(cè)定抗氧化能力測(cè)定中，5種提取物均顯示出一定的還原能力，不同組別存在一定差異，提取劑分別為70%乙醇和甲醇的兩組還原抗氧化能力大致相同，明顯高于其他組，而提取劑為石油醚、乙酸乙酯時(shí)，還原抗氧化能力最弱。

3.3 ABTS自由基清除能力

圖3為ABTS法測(cè)定人心果樣液清除ABTS自由基的結(jié)果。不同組別存在一定差異，選用70%乙醇測(cè)得的活性強(qiáng)度最高，其次為水和甲醇，石油醚和乙酸乙酯的活性強(qiáng)度最弱。

3.4 總黃酮含量測(cè)定

從圖4可知，在人心果的總黃酮含量測(cè)定中，不同組別測(cè)定的含量存在一定差別。乙酸乙酯組測(cè)定的結(jié)果明顯較高，甲醇及70%乙醇的總黃酮含量一般且基本相同，含量最低的是石油醚和水。

3.5 相關(guān)性分析

通過(guò)表5可知，在0.05水平（單側(cè)）上，ABTS自由基清除法與FRAP法測(cè)得抗氧化活性強(qiáng)度呈顯著相關(guān)，使用DPPH法測(cè)得的活性強(qiáng)度結(jié)果與總黃酮含量相關(guān)。

3.6 Topsis綜合分析

為進(jìn)一步綜合研究比較各種提取劑對(duì)人心果測(cè)定結(jié)果的影響，研究對(duì)測(cè)定的結(jié)果采用了Topsis綜合分析。

從表6中可得知，經(jīng)過(guò)綜合分析比較，這5種溶劑中用70%乙醇提取人心果抗氧化活性物質(zhì)效果最佳，其次是乙酸乙酯、甲醇和水，石油醚效果最差。

4 結(jié)論與討論

近年來(lái)，抗氧化活性研究在不同溶劑提取某種物質(zhì)的相關(guān)研究中較為常見，牛德芳等[14]對(duì)油菜蜂花粉、蜂糧的水和醇提取物研究中發(fā)現(xiàn)，利用醇提取的蜂花粉和蜂糧測(cè)定結(jié)果比水好。趙玉紅等[15]用多種溶液對(duì)薔薇葉花青素、總黃酮、總酚進(jìn)行提取并測(cè)定抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)60%乙醇提取物的含量較高。田強(qiáng)等[16]對(duì)厚樸籽不同溶劑的萃取物進(jìn)行比較分析，得到的結(jié)論是乙酸乙酯提取效果最好，與本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Topsis分析后發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯組的活性較強(qiáng)的結(jié)論類似。如果需要全面、科學(xué)地評(píng)價(jià)研究對(duì)象的抗氧化能力，應(yīng)采用更合理科學(xué)的抗氧化活性測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，如ORAC法。ORAC法測(cè)量總體抗氧化能力，可以客觀地反映出即刻脂質(zhì)過(guò)氧化程度[17]。

通過(guò)結(jié)果分析可知，提取劑的不同會(huì)影響到人心果抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果，在這5種提取劑中，乙酸乙酯最適合用于DPPH法對(duì)人心果的測(cè)定，70%乙醇、甲醇適合用于FRAP法對(duì)人心果的測(cè)定，70%乙醇適合用于ABTS法對(duì)人心果的測(cè)定。通過(guò)綜合分析之后，70%乙醇是較適合人心果的提取劑。此外，從結(jié)果分析中可以知道DPPH法結(jié)果與總黃酮含量在0.05水平（單側(cè)）上相關(guān)，人心果的抗氧化能力與總黃酮含量也存在良好的相關(guān)性。

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（責(zé)任編輯：趙中正）