大豆油脂的合成途徑及關(guān)鍵酶GPAT基因的研究進(jìn)展

魯中爽，劉思言，李廣隆，王 蕊，劉明明，么夢(mèng)凡，關(guān)淑艷，姚 丹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

大豆〔Glycine max（Linn.）Merr.〕隸屬于豆科大豆屬，為一年生草本植物［1］，在全球范圍內(nèi)都有廣泛種植。大豆含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)及多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［2-3］，其中大豆油脂目前仍占據(jù)世界總食用植物油脂的首位。我國(guó)不僅是大豆原產(chǎn)國(guó)，也是世界上最大的大豆進(jìn)口國(guó)，由于國(guó)產(chǎn)大豆的產(chǎn)量和產(chǎn)油率不高，隨著石油資源的日益缺乏、人類對(duì)高質(zhì)量油脂需求的增長(zhǎng)、對(duì)可再生資源的依賴性和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，培育各種比例更健康的油料和提高大豆油脂含量有很大的市場(chǎng)需求。面對(duì)國(guó)內(nèi)對(duì)豆油的需求量日漸提高，以及在未來(lái)較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)我國(guó)仍需繼續(xù)進(jìn)口大量大豆及豆油的局面將很難發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變，因此提高我國(guó)大豆種子中的油脂含量，獲得高油轉(zhuǎn)基因大豆用于大豆油的生產(chǎn)具有重要意義，科研工作者有義務(wù)研究如何更好地提高大豆植物油脂含量及品質(zhì)［4-5］。

隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，大量植物功能基因被分離并克隆出來(lái)，合成植物油脂的代謝途徑中某些調(diào)控基因的分子機(jī)制和表達(dá)調(diào)控方式的闡明，對(duì)利用基因工程手段從分子水平上有針對(duì)性地改良大豆油料作物，生產(chǎn)有用的脂肪酸、提高植物油脂的質(zhì)量及增加機(jī)體的抗逆性等發(fā)揮重要作用，這種新發(fā)展的分子育種沖破了傳統(tǒng)育種的阻礙，是一種很有研究?jī)r(jià)值的育種手段［6-7］。三酰甘油是大豆油脂的主要成分，而脂肪酸是三酰甘油的來(lái)源產(chǎn)物，因此調(diào)節(jié)終產(chǎn)物三酰甘油和脂肪酸的合成表達(dá)，是提高大豆油脂的主要途徑之一。在三酰甘油的合成過(guò)程中，甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）是合成途徑中第一步反應(yīng)關(guān)鍵酶，生物合成的限速酶，最終將脂肪酸催化形成三酰甘油，改變GPAT活性影響大豆油脂的組成和積累。因此通過(guò)分子育種技術(shù)手段過(guò)表達(dá)GPAT基因來(lái)改良大豆油脂并對(duì)油料作物育種有重要意義。

1 大豆油脂

1.1 大豆油脂的組成

大豆油脂的化學(xué)成分為三酰甘油（triacylglycerol，TAG），由甘油和3分子長(zhǎng)鏈脂肪酸在多種酶的催化下形成，因此脂肪酸是植物油脂的重要組成成分，植物油脂的質(zhì)量及在各方面的用途受脂肪酸的組成影響。

大豆油脂主要在質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，脂肪酸前體在質(zhì)體中通過(guò)聚合反應(yīng)生成飽和脂肪酸，在硬脂酰-ACP脫飽和酶（SAD）的催化下生成18∶1-ACP，作為游離脂肪酸的底物，在?；o酶A合成酶的作用下，合成酰基輔酶A并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。后通過(guò)一系列酶的作用合成油脂前體 -TAG［8］。

1.2 大豆油脂的代謝合成途徑

油脂的合成代謝是維系其生命活動(dòng)的基本代謝之一，也為人類提供了重要的能量來(lái)源，主要分為：脂肪酸的從頭合成、脂肪酸的脫飽和、三酰甘油的合成及油體形成，合成途徑如圖 1 所示［9］。

圖1 大豆油脂代謝合成途徑

1.2.1 脂肪酸的從頭合成 蔗糖是油脂合成的代謝的主要碳源，蔗糖通過(guò)糖酵解、磷酸戊糖途徑和卡爾文循環(huán)生成磷酸二羥丙酮和乙酰輔酶A作為三酰甘油的合成原料［10］。乙酰輔酶A在乙酰基輔酶A羧化酶作用下生成丙二酰輔酶A，再與?；d體蛋白結(jié)合，在丙二酰輔酶A?；d體蛋白轉(zhuǎn)移酶生成丙二酰-ACP（MCAT）的催化下生成丙二酰ACP。隨后，一分子乙酰輔酶A與多分子丙二酰輔酶A在脂肪酸合酶復(fù)合體的作用下，經(jīng)縮合、羰基還原、脫水，再還原多次循環(huán)，每多一個(gè)循環(huán)β-酮脂?；鵄CP比上一循環(huán)多兩個(gè)碳原子的?；鵄CP逐步生成含12～18個(gè)碳脂肪酸［11］。

1.2.2 脂肪酸的脫飽和 SAD催化18:0-ACP形成18∶1-ACP單不飽和脂肪酸；另外通過(guò)?；?ACP硫酰酶（FAT）催化部分18:1-ACP單不飽和脂肪酸生成自由脂肪酸。自由脂肪酸在長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶的作用下生成?；o酶A為三酰甘油的合成提供底物并運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。另外在一系列酶的作用下將剩下的18∶1-ACP單不飽和脂肪酸生成磷脂酰膽堿（PC），PC是FAD的唯一底物來(lái)源。在FAD 的作用下生成亞油酸、亞麻酸［12］。

1.2.3 三酰甘油的合成 Kennedy途徑即脂酰輔酶A和甘油三磷酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中先由GPAT催化形成1-單酰甘油三磷酸；隨后在溶血磷酸?；D(zhuǎn)移酶（LPAAT）催化下形成PA；磷脂酸磷酸化酶使PA去磷酸基，形成DAG；最后在DGAT的作用下與另一分子脂酰輔酶A形成TAG。另外磷脂酰膽堿（PC）sn-2位上的?；诹字８视王；D(zhuǎn)移酶（PDAT）作用下轉(zhuǎn)移到DAG上，形成TAG和LPAA。還有逆脂酰轉(zhuǎn)移酶（TA）將二酰甘油上的一個(gè)脂?；D(zhuǎn)移到另一個(gè)二酰甘油上，形成三酰甘油和一酰甘油［13-14］。三酰甘油所含有的3個(gè)脂肪酸可以是飽和脂肪酸也可以是不飽和脂肪酸，可以是相同的脂肪酸也可以是不相同的脂肪酸［12］。

1.2.4 油體形成 油體蛋白與三酰甘油形成油體。三酰甘油在油體中成液態(tài)，油體蛋白在外面包裹的半單位膜中，由半單位膜包裹液態(tài)基質(zhì)三酰甘油脂形成油體。而高含量的三酰甘油可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)中形成“脂質(zhì)凸起”進(jìn)而從膜結(jié)構(gòu)中分離出來(lái)，形成油體。烘干種子過(guò)程中植物油體蛋白能夠保持油體穩(wěn)態(tài)，并在油體之間相互作用和改變油體膜結(jié)構(gòu)中起到重要作用［15］。

1.3 大豆油脂的功能

大豆油脂是國(guó)際市場(chǎng)上重要商品之一，是醫(yī)藥、化工、生物柴油等原料［16-18］，也是居民餐飲中重要的食物能源，同時(shí)還可作為一種可再生的生物能源。隨著國(guó)內(nèi)油料消費(fèi)增加，油料加工產(chǎn)品需求的快速增長(zhǎng)，帶動(dòng)了國(guó)內(nèi)油脂油料種植業(yè)的發(fā)展，因此研究如何提高大豆油脂的產(chǎn)量至關(guān)重要。

脂肪酸作為細(xì)胞組成的重要成分又是重要能源物質(zhì)，還是某些信號(hào)分子的前體，與人類的生活緊密聯(lián)系，很多研究者一直很重視對(duì)脂肪酸的研究［19］。大豆油脂的結(jié)構(gòu)成分主要是不飽和脂肪酸，對(duì)維持植物膜系統(tǒng)液晶狀態(tài)和延長(zhǎng)植物細(xì)胞有重要作用，同時(shí)構(gòu)成葉綠體膜骨架的主要成分也是不飽和脂肪酸，起著對(duì)類囊體穩(wěn)定的作用［20］。大豆不飽和脂肪酸對(duì)人體具有降低人體中膽固醇含量、減少腦血栓的形成的作用，對(duì)動(dòng)脈硬化和心腦血管疾病的預(yù)防和治療起到保健作用，而過(guò)多攝取飽和脂肪酸可增加患有心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。提高不飽和脂肪酸中的亞油酸、亞麻酸可增加生物燃料釋放的能量、降低廢渣溫度而提高利用率，高油酸的生物燃料的氧化穩(wěn)定性更高，油脂中亞麻酸含量高會(huì)導(dǎo)致大豆油保質(zhì)期減短，大豆油易酸敗，而人體中不能合成身體所需的亞油酸和亞麻酸的必須脂肪酸，必須從植物中攝取得到，因此根據(jù)人體和工業(yè)需求不同，培育不同配比脂肪酸的大豆品種具有可行性，提高大豆油脂具有一定的應(yīng)用價(jià)值［21］。

2 甘油三磷酸轉(zhuǎn)移酶（GPAT）

2.1 GPAT基因分類

GPAT基因在擬南芥、菠菜、向日葵、豌豆、水稻等多種植物中被克隆出來(lái)，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)GPAT基因家族有ATS1、AtGPAT1/2/3/4/5/6/7/8/9 等10個(gè)成員，其中ATS1定位于質(zhì)體，AtGPAT1/2/3定位于線粒體，AtGPAT4/5/6/7/8/9定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［22-23］。AtGPAT1/4/5/6/7/8具有sn-2?；D(zhuǎn)移活性，AtGPAT4/6/8還具有磷酸酶活性［24］。很多研究表明AtGPAT1與養(yǎng)分的分泌和絨氈層分化有關(guān)［25］；AtGPAT4與植物莖、葉中角質(zhì)的合成有關(guān)，AtGPAT5與木栓質(zhì)脂肪族化合物的積累有關(guān)，影響木質(zhì)栓的合成，AtGPAT6/8與花瓣中角質(zhì)的合成有關(guān)，AtGPAT9與家族中其他幾個(gè)成員的一致性在10%左右，與動(dòng)物中GPAT4結(jié)構(gòu)域有很高的同源性，參與脂肪細(xì)胞中脂肪酸的合成，并且不同植物的GPAT9氨基酸的保守性很高，在種胚發(fā)育期表達(dá)量顯著提高，導(dǎo)致AtGPAT9對(duì)大豆油脂的積累起到重要的調(diào)控作用。但GPAT家族中哪個(gè)基因在種子發(fā)育中大量表達(dá)仍需研究［26］。

2.2 GPAT基因分子特征

GPAT的C端序列較為保守，在靠近C端的區(qū)域所有GPAT基因都含有脂?；呋Y(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中有4個(gè)（模體I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）高度保守的模體。這些模體對(duì)GPAT的脂?；D(zhuǎn)移酶活性及其結(jié)合G3P底物至關(guān)重要。不同的GPAT的N端序列差別較大，因此不同的GPAT之間的分子大小、生化特性及亞細(xì)胞定位也有所不同。同時(shí)不同的GPAT具有（脂酰基鏈長(zhǎng)度、不飽和度及ω-氧化程度的選擇性）不同的脂?；N類, 從而參與不同的脂質(zhì)代謝過(guò)程［27］。

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，GPAT是三酰甘油合成途徑中第一關(guān)鍵酶，主要負(fù)責(zé)將飽和脂肪酸酰基轉(zhuǎn)移到甘油三磷酸（G-3-P）的sn-1號(hào)位上，形成溶血磷脂酸（LPA）。隨著研究發(fā)現(xiàn)，GPAT還可將?；D(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到G-3-P的sn-2號(hào)位上，可產(chǎn)生sn-2LPA或sn-2-單酰甘油（sn-2MAG），但具有?；D(zhuǎn)移sn-2位特異性的GPAT只在陸生植株中被發(fā)現(xiàn)，因此生化分子生物學(xué)國(guó)際聯(lián)合酶學(xué)委員會(huì)命名這一具有?；D(zhuǎn)移到sn-2位上的特異性GPAT酶為EC2.3.1.198［24］。

大多數(shù)GPAT酶（GPAT1、GPAT2、GPAT3、GPAT4 和GPAT5）已被報(bào)道居住在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，通過(guò)保守的跨膜基序錨定在那里。GPAT1受位于30 kb間的近端和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子的調(diào)控，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成三酰甘油（TAG）的第一步限速步驟是由GPAT3 或GPAT4催化的，它將G-3-P和脂肪酰輔酶A（FA-CoA）轉(zhuǎn)化至LPA。然后通過(guò)GPAT酶將LPA轉(zhuǎn)化為磷脂酸（PA），PA隨后通過(guò)脂蛋白PAP酶（lipin 1,2或3）去磷酸化為二酰甘油（DAG），TAG生物合成的最后一步是將DAG轉(zhuǎn)化為由DGAT1和DGAT2催化的TAG，DGAT1和DGAT2的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位可能是不同的［28-29］。G-3-P途徑的酶除了調(diào)節(jié)TAG合成外，也影響磷脂合成，如：由GPATs產(chǎn)生的PA可作為合成酸性磷脂、磷脂酰乙醇或磷脂酰肌醇、心磷脂的底物；由脂蛋白PAP酶作用產(chǎn)生的DAG可以轉(zhuǎn)化為TAG或磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸［30］。

2.3 GPAT功能

GPAT催化酰基供體向?；D(zhuǎn)移［31］，磷脂酰甘油（PG）在酰基脂化酶GPAT的催化下，GPAT具有ACP的結(jié)合位點(diǎn)，它能催化?；o酶A或?；鵄CP到脂肪酰基的酯交換［32］，以為?；w的GPAT酶定位于質(zhì)體，屬胞質(zhì)溶解型GPAT；以acyl-CoA為酰基供體的GPAT酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體屬膜結(jié)合型GPAT。將acyl-ACP的?；D(zhuǎn)移到甘油三磷酸的sn-1位上合成溶血磷脂酸（LPA）［33］，該反應(yīng)構(gòu)成儲(chǔ)存-脂質(zhì)組裝的第一步，并且在極性和細(xì)胞外脂質(zhì)生物合成中也是重要的［34］。將acyl-CoA的?；D(zhuǎn)移到LPA的sn-2位上，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（LPAT）催化形成磷脂酸（PA），后續(xù)反應(yīng)之后形成 TAG［23］。

由于GPAT酶?；D(zhuǎn)移位點(diǎn)特異性和底物選擇性為脂質(zhì)合成提供了底物，GPAT在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，不同GPAT基因發(fā)揮著不同的表達(dá)模式，表現(xiàn)出多種生理功能：（1）與植物的育性有關(guān)：在擬南芥花粉發(fā)育過(guò)程中，AtGPAT1/6共同影響擬南芥的結(jié)實(shí)率，AtGPAT1/6突變體會(huì)阻礙雄蕊長(zhǎng)纖絲的伸長(zhǎng)和導(dǎo)致小孢子的釋放，減少授粉概率導(dǎo)致結(jié)實(shí)率降低［35］；（2）與植物的耐高溫、抗低溫有關(guān)：在酶學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)兩類GPAT，一是可以優(yōu)先選擇188∶1脂肪酸為底物的選擇型GPAT，二是以16:0脂肪酸為靶向底物優(yōu)先選擇18∶1脂肪酸的非選擇型GPAT，一些研究表明選擇型酶是耐冷植物，非選擇型酶是冷敏感植物，在較低溫度下，順式不飽和磷脂酰甘油（PG）比飽和磷脂酰甘油能更好地防止膜相變，在低溫下的流動(dòng)性及生物膜的飽和度影響耐冷性［36］；（3）與植物的耐干旱和耐高濃度鹽有關(guān)：AtGPAT突變體導(dǎo)致擬南芥幼根和種皮中軟木脂含量降低，由于軟木脂阻止病原體入侵植物的物質(zhì)，并能控制溶質(zhì)和水分的運(yùn)輸，因此在高鹽下容易失水，使得滲透性急劇增加和導(dǎo)致存活率降低［37］；（4）與種子含油量有關(guān)：GPAT基因是脂肪酸合成途徑中第一關(guān)鍵酶，擬南芥種子總脂肪酸的含量高達(dá)30.5%～40%，目前在擬南芥中已鑒定出9種GPAT基因，可見(jiàn)GPAT與油分組成相關(guān)，可提高種子重量和含油量［38］；（5）其他功能：具有磷酸酶活性，可能因GPAT基因編碼的酶其-N-端存在HAD-like 結(jié)構(gòu)域有關(guān)，GPAT可對(duì)受傷植物進(jìn)行修復(fù)傷口的功能，GPAT基因催化?；o酶A或?；鵄CP到脂肪?；孽ソ粨Q具有ACP的結(jié)合位點(diǎn)［37］。

3 GPAT基因在大豆油脂合成途徑中的應(yīng)用

最近幾年GPAT基因作為調(diào)節(jié)脂肪酸的關(guān)鍵基因，其表達(dá)涉及油脂的合成在某些植物中的應(yīng)用相繼開(kāi)展。2013年，郝靜芳［39］認(rèn)為GPAT7 和GPAT9參與擬南芥種子中TAG的合成及一些不飽和脂肪酸和調(diào)節(jié)。2014年，劉聰［37］在研究甘油型油菜的GPAT6基因的克隆與分析中發(fā)現(xiàn)GPAT6基因改變了擬南芥種子脂肪酸成分的比例；Sui等［40］在擬南芥中的通過(guò)過(guò)表達(dá)SsGPAT來(lái)提高磷脂酰甘油的不飽和脂肪酸含量，可以增強(qiáng)擬南芥耐鹽性并緩解鹽脅迫下PSII和PSI的光抑制。2016年，Niu等［41］在三角褐指藻中克隆了GPAT基因并在三角褐指藻中過(guò)表達(dá)，通過(guò)GC-MS分析脂肪酸組成，顯示與野生型相比有更高的不飽和脂肪酸比例，鑒定出的GPAT可以上調(diào)三角褐指藻中TAG的生物合成。2017年，Srinivasan等［42］發(fā)現(xiàn)AGPAT1過(guò)表達(dá)顯著改變了初級(jí)代謝，總脂質(zhì)含量增加，但總碳水化合物和可溶性蛋白質(zhì)含量降低，結(jié)果表明AGPAT1過(guò)表達(dá)可以提高TAG的生物合成；皮廣靜［43］在研究花生油脂合成?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)與籽仁含油量相關(guān)性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，GPAT3個(gè)時(shí)期平均表達(dá)量與含油量顯著正相關(guān)；Aparna等［44］克隆了麻風(fēng)樹(shù)的兩種GPAT基因并導(dǎo)入擬南芥中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)總油脂含量增加等。以上研究都證明了GPAT基因參與到調(diào)解脂肪酸的過(guò)程，對(duì)油脂的合成起到關(guān)鍵性作用。上述事例雖然都證明GPAT基因改變了油脂的含量，卻是不同GPAT成員對(duì)不同物種的油脂合成起到調(diào)控作用，其他物種中的GPAT基因的功能是否對(duì)油脂的合成起到調(diào)節(jié)作用還有待研究。

由于GPATs在不同時(shí)期和不同組織的表達(dá)模式存在顯著差異，預(yù)示著其參與不同的脂質(zhì)代謝和生物學(xué)過(guò)程中GPAT的不同。通過(guò)這些實(shí)例可以表明GPAT基因的表達(dá)影響脂肪酸的合成，對(duì)油脂含量起到調(diào)控作用。GPAT基因作為油脂合成途徑中關(guān)鍵的?；D(zhuǎn)移酶，大豆中也含有GPAT基因，但至今還未驗(yàn)證大豆GPAT基因是否對(duì)油脂的合成起到調(diào)控作用，同時(shí)大豆GPAT基因的活性和某些生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。因此研究GPAT基因表達(dá)及促進(jìn)大豆油脂合成的功能性分析可能對(duì)獲得高油轉(zhuǎn)基因大豆用于大豆油的生產(chǎn)具有重要意義。

4 展望

大豆油脂合成涉及大量的基因及其編碼的酶類，是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，改變?nèi)魏我粋€(gè)因素都可能造成植物含油量或者油酸成分的改變，因此弄清大豆油脂合成的每一個(gè)環(huán)節(jié)都具有重要意義。雖然GPAT基因作為油脂合成的關(guān)鍵酶，但目前對(duì)植物GPAT基因家族的認(rèn)知卻主要集中于擬南芥中。植物GPAT基因家族雖然只是一個(gè)小家族，卻具有多種功能，GPAT基因的多樣性和重要性很容易激起科研工作者對(duì)其深入研究的熱情。GPAT?；D(zhuǎn)移酶位點(diǎn)特異性和對(duì)底物的選擇性為什么會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到調(diào)控作用、單個(gè)還是多個(gè)GPAT 成員對(duì)油脂代謝合成途徑起作用以及大豆中GPAT基因的生物學(xué)功能等問(wèn)題還有待探索。

隨著人們對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，現(xiàn)在對(duì)油料作物的開(kāi)發(fā)與利用越來(lái)越重視，油料植物不僅可供人體需求還可作為環(huán)保清潔能源，在生活中很多方面都有應(yīng)用，科研工作者也越來(lái)越重視油料作物研究趨向人類需求的方向。大豆作為世界較大的產(chǎn)油作物，GPAT基因也是高等植物中油脂合成途徑中的關(guān)鍵酶，雖然GPAT基因在很多植物中都克隆出來(lái)并進(jìn)行了功能驗(yàn)證，但在大豆中的相關(guān)報(bào)道很少，利用基因工程等新科技手段，對(duì)大豆合成三酰甘油途徑中第一關(guān)鍵酶GPAT基因的克隆及驗(yàn)證功能還需科研工作者進(jìn)一步研究。