Bad蛋白磷酸化和剪切修飾對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用*

（聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院 神經(jīng)外科/無錫聯(lián)保中心創(chuàng)傷神經(jīng)外科中心，福建 漳州 363000）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生發(fā)展源自細(xì)胞增殖和/或凋亡的失衡，增加凋亡比重是放化療治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的重要機(jī)制[1-2]。B細(xì)胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）家族各亞型蛋白廣泛參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)生存/凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。Bcl-2相關(guān)死亡啟動(dòng)子同源基因Bad編碼蛋白是其中一類僅含保守性結(jié)構(gòu)域的亞型，磷酸化和剪切修飾是其各種生化活性的重要基礎(chǔ)。總結(jié)各種藥物處理和內(nèi)源性信號(hào)是如何通過調(diào)控Bad蛋白來實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)促凋亡或促生存信號(hào)通路的下游調(diào)控，有助于加深對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的理解，為尋找、設(shè)計(jì)、驗(yàn)證相關(guān)靶向藥物治療提供理論基礎(chǔ)。

磷酸化的Bad（p-Bad）與14-3-3形成異二聚體，作為其伴侶分子定位于細(xì)胞漿；而非磷酸化Bad則通過結(jié)合含穿膜結(jié)構(gòu)域的其他Bcl-2家族蛋白并形成異二聚體接近線粒體膜而發(fā)揮促凋亡作用。Bad在人體內(nèi)呈組織特異性分布，在腦內(nèi)尤其是內(nèi)側(cè)基底節(jié)區(qū)、下丘腦和海馬區(qū)表達(dá)最高。生理組織中的Bad總蛋白只包含非磷酸化Bad這一種成分，可發(fā)揮正常的促凋亡作用。但在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中Bad蛋白表達(dá)呈升高趨勢，由于各種生長因子信號(hào)途徑激活，起凋亡抑制作用的p-Bad成分也在增加[3-5]。有研究報(bào)道在惡性膠質(zhì)瘤U251、U87、U138細(xì)胞株和神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株中p-Bad的表達(dá)升高[6]。

1 Bad調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的一般機(jī)制

Bad能接受多種上游生存和/或凋亡信號(hào)并調(diào)控其轉(zhuǎn)導(dǎo)，其生化功能與其磷酸化狀態(tài)息息相關(guān)[7-9]。生存信號(hào)占主導(dǎo)時(shí)，Bad呈磷酸化狀態(tài)與胞漿中14-3-3穩(wěn)定結(jié)合。生存信號(hào)撤除或是接受上游凋亡信號(hào)后，Bad迅速去磷酸化并從Bad-14-3-3聚合物中解離。游離的非磷酸化Bad強(qiáng)烈干擾Bcl-xL-Bax聚合物的穩(wěn)定性，將Bax從中置換出來而形成Bad-Bcl-xL聚合物。解離后的Bax結(jié)合成同源二聚體作用于線粒體外膜形成跨膜小孔甚至大孔徑的線粒體通透性改變孔道，從而導(dǎo)致線粒體膜電位的變化和Cytc、AIF的外流，誘導(dǎo)凋亡事件的發(fā)生。對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的研究還發(fā)現(xiàn)，單一的Bad去磷酸化并不足以觸發(fā)凋亡機(jī)制，還需要抑制蛋白合成這一平行機(jī)制共同發(fā)揮作用。

2 Bad在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的磷酸化調(diào)節(jié)

2.1 Bad磷酸化的一般機(jī)制

Bad組成性序列中不同氨基酸位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)的改變對(duì)Bad生化活性的影響也不盡相同[10-12]。p-Bad的去磷酸化是很多藥物（NH4Cl、Raf抑制劑BAY 43-9006、FLT3抑制劑CEP-701、阿霉素）抑制生存信號(hào)途徑和啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要步驟，并且這一改變?cè)缬贐cl-2家族抗凋亡蛋白的表達(dá)降低和促凋亡蛋白的表達(dá)升高，而在這一過程中Bad總蛋白表達(dá)水平不變或增加。此外，p-Bad還可通過提高線粒體釋放Cytc的閾值抑制凋亡，由此可見p-Bad并不僅以失活的形式被動(dòng)地對(duì)凋亡產(chǎn)生影響，也可通過主動(dòng)的方式來發(fā)揮抑制凋亡的作用即提高Cytc從線粒體釋放的閾值。

2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)各磷酸化位點(diǎn)的協(xié)同機(jī)制

Bad磷酸化失控是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生的部分原因。c-Src的激活會(huì)上調(diào)PKCι的表達(dá)，PKCι的表達(dá)加強(qiáng)Bad S112、136、155磷酸化，從而增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性[10]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)非磷酸化狀態(tài)的Bad可在各種促生存信號(hào)如PIM-2激酶、p90（RSK）作用下磷酸化，從而抑制乃至逆轉(zhuǎn)凋亡的發(fā)生發(fā)展。Bad的磷酸化對(duì)于各條生存信號(hào)通路都是關(guān)鍵性的。沒有哪條促生存信號(hào)通路的活化能夠拯救Bad磷酸化位點(diǎn)變異的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。另一方面，RNA干擾條件下，Bad總體表達(dá)受到阻滯的膠質(zhì)瘤細(xì)胞則對(duì)凋亡信號(hào)敏感性降低。Bad S112和S136的磷酸化可以由IL-3、GM-CSF、PDGF、NGF或IGF刺激促成，在非毒性條件下甚至TNF也能完成這種磷酸化。磷酸化S112需要腎上腺素能α受體和β受體的同時(shí)激活，而磷酸化S155只需β受體的激活。S112有效磷酸化還需要活性PKA的參與，S155磷酸化可以增強(qiáng)S112磷酸化。可磷酸化位點(diǎn)的點(diǎn)變異則會(huì)取消Bad的磷酸化潛質(zhì)，從而增強(qiáng)Bad蛋白的凋亡誘導(dǎo)能力。IGF-1受體能保護(hù)細(xì)胞免受各種凋亡刺激的誘導(dǎo)，其抗凋亡作用基于募集MAPK亞家族Akt/PKB和ERK的作用。IGF-1處理后的細(xì)胞Bax/Bcl-2比值降低，增加Bad S112和S136的磷酸化。p21-激活蛋白激酶可在S338和S339位點(diǎn)磷酸化激活Raf-1，后者在磷酸化Bad S112位點(diǎn)的同時(shí)將Bad從Bad-Bcl-2聚合物中替換出來，促使細(xì)胞向存活方向發(fā)展。但也有研究認(rèn)為，Bad的磷酸化也不總是促使細(xì)胞向生存方向轉(zhuǎn)化，JNK可通過磷酸化S128來推動(dòng)凋亡，Bad蛋白S128的磷酸化通過抑制S136已磷酸化的Bad蛋白與14-3-3蛋白的聯(lián)系，促成Bad的寡聚化而特異性地激活Bad蛋白。盡管如此，該研究也同時(shí)提出JNK可能并不是Bad S128的激酶，JNK信號(hào)激活后的S128位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)可能與Bad促凋亡活性無關(guān)，這一觀點(diǎn)尚需要更多的實(shí)驗(yàn)研究予以證實(shí)[13]。

BH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)S155位點(diǎn)常被生存信號(hào)磷酸化，它的磷酸化改變對(duì)Bad/Bcl-xL的阻斷作用相對(duì)S112和136位點(diǎn)而言是直接的。磷酸化導(dǎo)致Bad以G（i）alpha依賴性的方式從Bad/Bcl-xL聚合物中解離[14]。目前的研究對(duì)S155的磷酸化是否獨(dú)立于S136位點(diǎn)的磷酸化意見不一。與Bcl-xL結(jié)合的Bad其S136被磷酸化以后構(gòu)象發(fā)生改變，使得S155磷酸化成為可能，但是S155并沒有已知的14-3-3結(jié)合序列，實(shí)際上，S155位點(diǎn)的變異并不影響B(tài)ad蛋白和14-3-3蛋白的結(jié)合，影響B(tài)ad與Bcl-xL的結(jié)合。在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中S136的磷酸化對(duì)維持Bad蛋白和14-3-3的聯(lián)系是至關(guān)重要的，而S112位點(diǎn)的磷酸化則看似可有可無，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)的變異并不影響B(tài)ad蛋白和14-3-3的結(jié)合。14-3-3與S136的親合力比S112要高得多，S112位點(diǎn)變異導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡可以由增強(qiáng)表達(dá)的14-3-3完全補(bǔ)救。

2.3 細(xì)胞毒性藥物對(duì)神經(jīng)元及膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Bad磷酸化的影響

NDGA和BFA孵育神經(jīng)元60～90 min后即表現(xiàn)出p-Bad去磷酸化，而Bcl-2蛋白的表達(dá)則需孵育2～3 h后才降低。大鼠暫時(shí)性全腦缺血和創(chuàng)傷性脊髓損傷后神經(jīng)元的凋亡與p-Bad去磷酸化水平呈正相關(guān)，p-Bad表達(dá)水平在脊髓損傷30 min后即降低并持續(xù)長達(dá)1 h。大麻素WIN 55212-2與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共孵育可導(dǎo)致p-Bad水平的下調(diào)但Bad總蛋白量并無變化；而醋酸亞鉈與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共孵育則上調(diào)Bad總蛋白表達(dá)。PPARc激動(dòng)劑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生Bax和Bad蛋白表達(dá)水平的一過性上調(diào)。

神 經(jīng)鈣調(diào)蛋白 磷酸酶（protein-phosphatase 2B,PP2B）也是Bad蛋白的重要調(diào)控因子，在腦內(nèi)大量分布，能在Ca2+低于10 nmol/L時(shí)保持適當(dāng)?shù)牧姿崦富钚裕坏┌l(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣超載，p-Bad可被PP2B去磷酸化。氰化物通過類似的機(jī)制將p-Bad去磷酸化，并使其自細(xì)胞漿持續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體外膜。PP2B的去磷酸化作用可能基于以下3點(diǎn)：①直接去磷酸化；②通過活化PP1將Bad去磷酸化；③PP2B誘導(dǎo)腦內(nèi)cAMP依賴性PKA Ⅱ型調(diào)控單元的去磷酸化，從而使之活性降低，導(dǎo)致Bad S155位點(diǎn)的去磷酸化。事實(shí)上，S112位點(diǎn)的磷酸化是EGFR/MEK/ERK/MAPK依賴性，而S136位點(diǎn)的磷酸化是PI3K/Akt依賴的。2位點(diǎn)中的任意一個(gè)去磷酸化都將促使Bad與14-3-3分離，但只有2位點(diǎn)均發(fā)生去磷酸化而同時(shí)抑制2條生存信號(hào)通路才能導(dǎo)致Bad從與14-3-3的聚合體中釋放出來并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

3 Bad的剪切修飾調(diào)節(jié)

3.1 Bad蛋白的常見剪切位點(diǎn)

藥物處理或撤除生存信號(hào)發(fā)生凋亡的細(xì)胞其Bad和Bax之類的Bcl-2蛋白可通過Caspase依賴性剪切生成具有更強(qiáng)促凋亡能力的截短型蛋白[15]。反義Smad3的表達(dá)可以阻滯Caspase依賴性的Bad剪切進(jìn)程，表明該進(jìn)程為Smad3依賴性。Caspase蛋白可在Asp56和Asp61位點(diǎn)裂解Bad，Caspase-3和Caspase-7在Asp61發(fā)揮裂解作用。人Bad敏感的Capsase切割位點(diǎn)在相當(dāng)于鼠Bad Asp56、Asp71的Asp4、Asp29。不同的死亡刺激信號(hào)促使不同的Caspase蛋白通過不同的作用位點(diǎn)剪切Bad，但盡管Caspase剪切可以加強(qiáng)人Bad的促凋亡活性，人Bad的剪切并非其促凋亡作用所必需的。Caspase-3通過Asp-61而不是Asp56切割Bad蛋白，而Caspase-7則只能切割鼠Bad蛋白而不能切割人Bad[16]。任何機(jī)制導(dǎo)致單純Bad N-端的缺失并不總是足以激活其促凋亡活性，表明N-端的作用是保證促死亡功能不被激活，而不是一個(gè)直接的抗死亡域。

3.2 Bad剪切修飾與磷酸化調(diào)節(jié)的相互關(guān)系

撤除IL-3 4～6 h后的鼠骨髓前體32Dcl3細(xì)胞，其促凋亡蛋白Bad自N-端被裂解成26和15 kD的tBadL（truncated Bad large,tBadL）和 tBadS（truncated Bad small,tBadS）。內(nèi)源性和增強(qiáng)表達(dá)的 tBadL 可以抑制神經(jīng)元和其他細(xì)胞的死亡，但Caspases還可以通過裁減tBadL成類似于tBadS的促凋亡片斷來進(jìn)一步發(fā)揮促凋亡活性。tBadS僅存在于線粒體，這可能是因?yàn)榧?xì)胞漿中tBadS具有高效的膜定位能力或者這種剪切發(fā)生在線粒體外膜，這也與Capase在線粒體的亞細(xì)胞定位、激活是一致的。tBadS其S112、S136、S155很少被磷酸化，這樣就不能與14-3-3蛋白發(fā)生有效反應(yīng)。這種低磷酸化可被強(qiáng)化的PP2B所修復(fù)。tBadS核心的BH3作用域得以暴露，這樣與Bcl-xL親合力更強(qiáng)，從而具有更強(qiáng)的促凋亡能力，并且由Bad與Caspase蛋白組成的正反饋循環(huán)又進(jìn)一步放大這種凋亡誘導(dǎo)能力。此外，Caspase也能剪切Bcl-2和BclxL。有意思的是，雖然后兩種蛋白一般被視作促生存信號(hào)蛋白，但是在Caspase剪切后將導(dǎo)致Cytc的釋放而成為促凋亡信號(hào)蛋白。與之不同的是，Bax蛋白在被Caspase剪切成18 kD的片斷之后，發(fā)揮更強(qiáng)的促凋亡作用。

4 Bad在溝通神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期信號(hào)和凋亡/生存信號(hào)中的作用

Bcl-2蛋白家族如Bad除了在眾所周知的凋亡調(diào)控能力外還能影響細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞周期進(jìn)程異?？赡苡|發(fā)線粒體途徑的激活，改變Bcl-2家族和促凋亡蛋白的平衡，推動(dòng)凋亡的形成和發(fā)展[13]。表達(dá)于未發(fā)育成熟的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白激酶cdc2能介導(dǎo)顆粒神經(jīng)元的凋亡，阻斷其神經(jīng)活性。cdc2磷酸化Bad蛋白S128位點(diǎn)，抑制S136磷酸化Bad與14-3-3的相互聯(lián)系，拮抗生存因子對(duì)Bad促凋亡活性的抑制，從而介導(dǎo)顆粒神經(jīng)元的凋亡。

p53與Bad蛋白的相互關(guān)系復(fù)雜。一方面，p53可以錨定于Bad基因起始密碼子上游，參與控制Bad基因的轉(zhuǎn)錄和活化；另一方面，Bad蛋白又可以通過與p53蛋白的結(jié)合，抑制其進(jìn)核后對(duì)Bad基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，在線粒體上形成的Bad/p53復(fù)合物還可以通過誘導(dǎo)Bad蛋白的活化和寡聚化促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

5 Bad的研究展望

Bad蛋白在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。內(nèi)源性和外源性凋亡信號(hào)和藥物處理信號(hào)都由Bad整理并轉(zhuǎn)呈至線粒體外膜，藉此觸發(fā)Caspase依賴性凋亡進(jìn)程。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，普遍存在著Bad和p-Bad的增量表達(dá)。很多放化療處理都可以降低p-Bad表達(dá)或使之去磷酸化失活，剪切Bad形成tBad以增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。外源性導(dǎo)入表達(dá)的Bad也能較好地融入凋亡調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生。處于凋亡網(wǎng)絡(luò)中樞的Bad是靶向治療理想的候選物，圍繞Bad開展的神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物研究和基因治療有望取得創(chuàng)造性的進(jìn)展。