外泌體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的研究進(jìn)展①

向清勇 萬偉國 劉佳滟 王令彪 鄒和建 楊 雪

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，復(fù)旦大學(xué)風(fēng)濕免疫過敏性疾病研究中心，上海200040)

外泌體(Exosomes)是一種能被細(xì)胞主動(dòng)分泌到胞外的微小囊泡，可存在于血液、尿液、唾液以及乳汁等多種體液中，其直徑約為30～100 nm，密度為1.13～1.21 g/ml，外泌體表面具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)并內(nèi)含細(xì)胞特異性的蛋白、脂質(zhì)和核酸等生物活性物質(zhì)，能保護(hù)其包被物質(zhì)的同時(shí)，也能靶向特定的組織和細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)功能[1]。同時(shí)不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不同的組成成分并發(fā)揮不同的功能，可作為細(xì)胞間通訊、疾病治療的重要載體以及疾病診斷和預(yù)后的重要標(biāo)志物。

1 外泌體的形成過程、表面標(biāo)志及功能

首次關(guān)于外泌體的報(bào)道是1983年P(guān)an等[2]在羊的成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞可釋放的一種膜性小囊泡，最初這種小囊泡被認(rèn)為是用來排出多余的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。1987年[3]這種小囊泡被命名為外泌體，進(jìn)一步的研究提示其由胞內(nèi)途徑生成，目前較為公認(rèn)的外泌體形成過程是細(xì)胞內(nèi)陷形成早期胞內(nèi)體，在內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物(ESCRT)及相關(guān)蛋白的調(diào)控下，早期胞內(nèi)體的界膜多處凹陷，向內(nèi)出芽形成管腔狀囊泡，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)閬喖?xì)胞結(jié)構(gòu)的多泡小體(MVBs)，MVBs最后在膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(GTPase)家族中的RAB酶的調(diào)節(jié)下與胞膜融合以出芽方式向胞外釋放形成外泌體[4,5]。

外泌體幾乎可以由所有種類的細(xì)胞分泌，并存在于人體各種體液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁等，外泌體可通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白GTPases、CD63、CD81及CD82等作為體外檢測(cè)及篩選的指標(biāo)。外泌體中還富含微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及蛋白等[8]。

2 不同免疫細(xì)胞來源外泌體的研究

免疫細(xì)胞作為機(jī)體發(fā)揮免疫功能的重要載體，傳統(tǒng)認(rèn)為主要通過細(xì)胞接觸及細(xì)胞因子及抗體分泌等機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，隨著近年來對(duì)細(xì)胞外泌體及其作用的逐漸認(rèn)識(shí)，免疫細(xì)胞的作用機(jī)制也得到了更新和發(fā)展。

2.1 固有免疫 固有免疫細(xì)胞主要包括單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)及NK細(xì)胞等。目前研究較多的是巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞來源的外泌體。細(xì)菌感染后的巨噬細(xì)胞來源的外泌體具有免疫調(diào)節(jié)作用，其分泌的外泌體可刺激巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞分泌TNF-α、RANTES等促炎因子[9,10]；并通過TLR途徑刺激受體細(xì)胞[11]。人巨噬細(xì)胞分泌的外泌體攜帶合成白三烯B4和白三烯C4酶，可促進(jìn)粒細(xì)胞的遷移[12]；而LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能有效減輕完全弗氏佐劑(CFA)注射后的小鼠足掌腫脹及減輕CFA誘導(dǎo)的炎性疼痛相關(guān)的熱痛覺過敏[13]，發(fā)揮抑炎作用；中性粒細(xì)胞來源的外泌體能迅速被氣道平滑肌(Airway smooth muscle,ASM)細(xì)胞內(nèi)化，并改變其增殖特性；被LPS刺激后的中性粒細(xì)胞來源的外泌體可增強(qiáng)ASM細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致病情加重和對(duì)激素不敏感哮喘患者的氣道重塑[14]。DC來源的外泌體可以被上皮細(xì)胞吸收，并且促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)(MCP-1、IL-8、TNF-α、RANTES)的釋放，提示外泌體促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)[15]；同時(shí)有研究顯示DC可通過其衍生的外泌體抑制小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的發(fā)生并降低其嚴(yán)重性，主要通過產(chǎn)生indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)和IL-10 發(fā)揮免疫抑制作用[16,17]；提示同一細(xì)胞來源的外泌體在不同的微環(huán)境中發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用，外泌體也是一把“雙刃劍”，需要我們?cè)诓煌募膊『筒煌奈h(huán)境中對(duì)其功能進(jìn)行認(rèn)識(shí)，不能一概而論。

2.2 適應(yīng)性免疫 適應(yīng)性免疫細(xì)胞主要包括T、B淋巴細(xì)胞。傳統(tǒng)認(rèn)為參與細(xì)胞免疫的T淋巴細(xì)胞主要通過分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-13、IL-17、IL-21)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；現(xiàn)有研究表明，在T細(xì)胞中，Wahlgren等[18]證實(shí)被相關(guān)抗體(IL-2、anti-CD3、anti-CD28)刺激的T細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體可作為自身信號(hào)物質(zhì)調(diào)節(jié)初始T細(xì)胞的分化，用自身外泌體刺激的初始T細(xì)胞可導(dǎo)致CD4+T的增加、CD8+T的降低；T細(xì)胞產(chǎn)生的富含microRNA的外泌體可單向轉(zhuǎn)移至B細(xì)胞和抗原提呈(APC)細(xì)胞中，其中由MHC Ⅱ類分子參與形成的免疫突觸在此過程中發(fā)揮重要作用[19]，而CD8+T細(xì)胞分泌的表達(dá)FasL的外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖影響不大，但可通過Fas/FasL途徑促進(jìn)B16和3LL癌細(xì)胞的體外侵襲[20]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是目前研究相對(duì)較多的T細(xì)胞亞群，研究表明Treg來源的外泌體表達(dá)免疫調(diào)節(jié)分子(CD25、CD73、CTLA4)，具有免疫抑制作用，可以調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[21]。Okoye等[22]研究表明Treg來源的外泌體及其中的let-7d基因能夠抑制Th1細(xì)胞的增殖和IFN-γ的分泌。抑制性T細(xì)胞來源的外泌體通過抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞影響巨噬細(xì)胞，其中活性氧中間體(ROI)參與了抗原特異性耐受機(jī)制[23]；而Th17細(xì)胞及濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞來源的外泌體研究目前尚未見相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步的研究。

B淋巴細(xì)胞主要通過分泌抗體來實(shí)現(xiàn)其體液免疫的調(diào)節(jié)功能，現(xiàn)有的研究表明B淋巴細(xì)胞可釋放表達(dá)MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子、CD80、CD86、CD54的外泌體，與抗原提呈相關(guān)分子有著同樣的功能，可將抗原提呈給淋巴細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞的激活[24]；而人類B細(xì)胞衍生的淋巴母細(xì)胞系(Lymphoblastoid cell lines,LCL)可組成性地產(chǎn)生MHCⅡ+FasL+表達(dá)的外泌體誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的凋亡[25]?？傮w來說，B細(xì)胞來源的外泌體表達(dá)及功能的相關(guān)研究目前仍較有限，有待進(jìn)一步的研究及應(yīng)用。

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，對(duì)T、B淋巴細(xì)胞分泌的外泌體及其功能的研究較為有限，尤其結(jié)合到某一個(gè)具體的自身免疫性疾病，T、B淋巴細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)淋巴細(xì)胞本身的自分泌及對(duì)全身其他免疫細(xì)胞及靶細(xì)胞的旁分泌作用如何？有多大程度參與及發(fā)揮免疫作用？以及對(duì)疾病的調(diào)節(jié)作用及作用機(jī)制如何？仍有待于進(jìn)一步的探索和研究。

3 外泌體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的相關(guān)研究

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是臨床常見的自身免疫病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但機(jī)體中的淋巴細(xì)胞存在明顯的紊亂。在SLE中，凋亡小體清除能力的缺陷和代謝產(chǎn)物的累積是自身抗原的主要來源[26]，特異性的外泌體及其內(nèi)含物質(zhì)作為SLE病情活動(dòng)和預(yù)后進(jìn)展的生物標(biāo)志物，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究中得到越來越多的關(guān)注和重視。

現(xiàn)有研究表明，SLE患者中外泌體水平顯著高于健康人群，且SLE患者的外泌體能夠在體外Toll樣受體存在的條件下促進(jìn) IFN-α、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，缺乏外泌體的SLE患者血清或者外泌體被破壞后則不能促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提示血清中外泌體水平升高且可作為狼瘡活動(dòng)度的指標(biāo)[27]，同時(shí)，也提示我們外泌體參與了細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放；Nielsen等[28]的研究顯示內(nèi)皮細(xì)胞來源的囊泡數(shù)量與狼瘡的疾病活動(dòng)度、腎小球腎炎和血管功能異常密切相關(guān)，內(nèi)皮來源囊泡的表型可作為狼瘡相關(guān)血管病變的特異性生物標(biāo)志；Parker等[29]的研究進(jìn)一步證明使用免疫抑制治療后可減少循環(huán)中內(nèi)皮細(xì)胞來源的囊泡數(shù)量并降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但內(nèi)皮來源的囊泡本身是否也參與了這些靶細(xì)胞和靶器官損傷值得進(jìn)一步的研究；Ostergaard等[30]的研究則提示在狼瘡患者外周血中存在特殊的囊泡譜，與正常人或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者比較具有差異且存在微管和細(xì)胞骨架成分減少，但這些特殊的囊泡的來源細(xì)胞目前也尚不明確；Nielsen等[31]證實(shí)狼瘡患者循環(huán)中的外泌體IgG、 IgM、 C1q的表達(dá)比健康人外泌體中的表達(dá)有所增加，并且與血漿 IgG、 抗dsDNA抗體、 抗ENA抗體、抗組蛋白抗體的濃度及低水平的白細(xì)胞呈正相關(guān)，因此認(rèn)為外泌體是SLE自身免疫性抗原的來源之一，更有效地引起相應(yīng)抗體的產(chǎn)生，參與SLE的發(fā)病機(jī)制并調(diào)控疾病活動(dòng)性。除外泌體本身，其中富含的并且被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外的miRNA、lncRNA和蛋白成分，也可作為評(píng)估臨床疾病的有效指標(biāo)；據(jù)報(bào)道m(xù)iR-146a在狼瘡患者PBMCs、血漿和血清中均低表達(dá)，可能有助于SLE患者的1型干擾素(IFN)途徑的改變[32-34]，但在LN患者的腎小球組織中miR-146a則高表達(dá)[35]。

狼瘡性腎炎(LN)是臨床SLE的常見并發(fā)癥，腎臟受累的患者中有10%～30%可進(jìn)展為終末期腎病[36]，因此，研究新的生物標(biāo)志物早期評(píng)估腎小球損傷，避免有創(chuàng)活檢已經(jīng)成為臨床亟待解決的問題。尿液是新型生物標(biāo)志物的理想生物液體，Pisitkun等[37]對(duì)尿液中的外泌體進(jìn)行鑒定和表型分析，證實(shí)尿液外泌體可作為穩(wěn)定的miRNA生物標(biāo)志物的來源。Solé等[38]研究發(fā)現(xiàn)尿液外泌體中MiR-29c的水平和LN患者腎臟病慢性化指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，但是與腎功能指標(biāo)無明顯相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)為LN患者提供了一個(gè)預(yù)測(cè)腎臟纖維化進(jìn)程的非侵入性指標(biāo)的可能，亦有研究表明成熟miRNA在尿液外泌體中的分布高于尿液的其他成分；同樣miR-146a也受到了研究者關(guān)注，研究表明活動(dòng)期狼瘡腎炎患者尿液外泌體中miR-146a表達(dá)明顯升高；另在腎小球疾病及LN患者的尿液外泌體中發(fā)現(xiàn)黏附分子ADAM10的蛋白水平較高，可作為早期腎小球疾病的生物學(xué)標(biāo)志[39]。

盡管近年來外泌體在狼瘡中的研究有一些新的進(jìn)展，但仍較有限；已有的研究主要把外泌體作為評(píng)估疾病活動(dòng)度及腎臟受累的指標(biāo)。但隨著研究的進(jìn)展，我們發(fā)現(xiàn)外泌體不僅僅作為疾病活動(dòng)和臟器受累的指標(biāo)，它同時(shí)也是疾病發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)節(jié)因子和/或致病因子，借助其可通過體液循環(huán)到達(dá)全身的特點(diǎn)，在不同的微環(huán)境下發(fā)揮不同的生理/病理、促炎/抑炎的雙向調(diào)節(jié)作用。而在以免疫功能失調(diào)為疾病特點(diǎn)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中，外泌體作為新的治療載體或靶點(diǎn)具有良好的前景和潛力，值得進(jìn)一步的關(guān)注和探索。

4 結(jié)語

目前，外泌體在腫瘤、炎癥等方面的研究較多，但在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中的研究仍較有限?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，外泌體在疾病預(yù)測(cè)、靶向治療等方面具有很大的潛能，外泌體中的相關(guān)物質(zhì)如miRNA等也可作為病情預(yù)警、診斷、評(píng)估的重要指標(biāo)以及有望作為后續(xù)治療的可靠載體。但外泌體確切的病理生理功能及其作為治療靶點(diǎn)的作用和機(jī)制需要進(jìn)一步的研究闡明及驗(yàn)證。研究的最終目的是將外泌體應(yīng)用于臨床，因此需要更優(yōu)化的細(xì)胞來源及更安全有效的治療性外泌體及外泌體成分。希望通過對(duì)外泌體研究的不斷深入，為系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的診斷和治療提供更多的選擇和幫助。