當(dāng)歸頭與尾阿魏酸代謝模式研究初探?

楊 杰，張 瑜，萬(wàn) 斌，范光忠，彭啟倫

(1.畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 畢節(jié) 551700； 2. 重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 401331； 3. 重慶市中醫(yī)院，重慶 401331)

當(dāng)歸作為“血中之圣藥”，不同藥用部位的功效明顯不同，但是不同藥用部位臨床療效差異的科學(xué)依據(jù)，尚待深入揭示。我們認(rèn)為，當(dāng)歸頭與尾功效差異源于次生代謝產(chǎn)物含量的差異，次生代謝產(chǎn)物含量差異源于酶含量與活性差異，而酶活性差異的根本原因是相關(guān)基因群的差異表達(dá)。基于該研究思路，由于當(dāng)歸頭與尾阿魏酸含量差異被相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，并結(jié)合課題組前期研究基礎(chǔ)，因此本文以當(dāng)歸主要活性成分阿魏酸的代謝調(diào)控為切入點(diǎn)，深入探討當(dāng)歸不同藥用部位藥效成分代謝調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制。

1 當(dāng)歸頭、歸身、歸尾功效不同臨床運(yùn)用考究

當(dāng)歸不同部位入藥的功效差異被廣泛闡述，尤以李東恒“頭止血而上行，身養(yǎng)血而中守，梢破血而下流，全活血而不走”之描述最為精辟。明代著名醫(yī)家李時(shí)珍指出：“治上用頭，治中用身，治下用尾，通治全用”，對(duì)當(dāng)歸不同部位功效差異做出了重要論斷，后世醫(yī)家對(duì)此有所發(fā)揮。如治療中風(fēng)后遺癥的補(bǔ)陽(yáng)還五湯(《醫(yī)林改錯(cuò)》)以歸尾活血，有祛瘀而不傷血之妙；仙方活命飲(《校注婦人良方》)用歸尾解毒化瘀；血府逐瘀湯配以歸尾益氣活血，通竅明目；犀角地黃湯以歸尾破血逐邪，俾瘀血破而邪熱透[1-4]。因此，當(dāng)歸不同藥用部位的功效差異，具有重要的臨床意義。

嚴(yán)輝等[2]應(yīng)用中藥方劑數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘當(dāng)歸不同入藥部位藥性特點(diǎn)及其適應(yīng)癥的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)歸尾主要應(yīng)用于活血(52.2%)，歸頭因臨床應(yīng)用方少而功效取向性不明顯；當(dāng)歸頭與尾功效差異主要表現(xiàn)為活血功效，而活血差異源于活血藥效成分含量的差異，如阿魏酸、藁本內(nèi)酯等。阿魏酸是當(dāng)歸主要水溶性活性成分，常作為當(dāng)歸質(zhì)量鑒定的標(biāo)志性化合物，具有抑制血小板聚集、抗血栓及心臟保護(hù)等藥理活性[5-7]。因此，當(dāng)歸頭與尾功效差異與主要水溶性活性成分阿魏酸含量差異密切相關(guān)。

2 當(dāng)歸不同部位、不同生長(zhǎng)期的藥效成分譜存在明顯差異

2.1 當(dāng)歸不同部位藥效成分譜差異懸殊

已知當(dāng)歸藥效成分包括揮發(fā)油成分、水溶性成分、微量元素等類型近100種。當(dāng)歸頭與尾功效差異源于藥效成分譜差異。吳國(guó)霞等[8]采用HPLC-MS分析全當(dāng)歸、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸身及當(dāng)歸尾所含化學(xué)成分，并定性鑒定出色氨酸、綠原酸、阿魏酸等8種當(dāng)歸藥用成分，其相對(duì)含量在當(dāng)歸不同藥用部位中存在顯著差異。裴建云等[9]應(yīng)用GC-MS聯(lián)合技術(shù)檢測(cè)，然后采用正交投影法分別定性鑒定出67種當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分，其含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吳國(guó)霞、楊秀娟等[10]采用HPLC及分光光度法測(cè)定阿魏酸含量，建立基于灰色關(guān)聯(lián)度模型的當(dāng)歸不同藥用部位的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸尾相對(duì)關(guān)聯(lián)度為0.576，高于當(dāng)歸身和當(dāng)歸頭樣品。上述研究采用不同分析方法，從不同角度證實(shí)當(dāng)歸頭與尾藥效成分譜存在較大差異。

2.2 當(dāng)歸藥效成分譜在不同生長(zhǎng)時(shí)點(diǎn)存在明顯差異

當(dāng)歸屬傘形科多年生草本植物，其藥效成分的形成與當(dāng)歸生長(zhǎng)期密切關(guān)聯(lián)。楊應(yīng)文等[11]應(yīng)用1H-NMR法研究當(dāng)歸多糖、阿魏酸和藁本內(nèi)酯等3種當(dāng)歸活性成分隨生長(zhǎng)過(guò)程的相對(duì)含量動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)第1年變化比較平穩(wěn)，在第2年和第3年變化比較快速。肖宇奇等[12-13]采用HPLC法分析不同生長(zhǎng)期當(dāng)歸化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)的采收期水溶性成分阿魏酸含有量最高，而Z-藁本內(nèi)酯等揮發(fā)油成分的含有量并不比其他生長(zhǎng)期高，提示當(dāng)歸次生代謝產(chǎn)物的積累與生長(zhǎng)周期相關(guān)。上述成果為進(jìn)一步揭示當(dāng)歸阿魏酸代謝模式、提高藥材品質(zhì)提供了有力依據(jù)。

3 當(dāng)歸阿魏酸代謝調(diào)控與酶活性密切相關(guān)

阿魏酸是桂皮酸的衍生物，以水溶態(tài)、脂溶態(tài)和束縛態(tài)等3種狀態(tài)存在。水溶態(tài)阿魏酸存在于植物細(xì)胞質(zhì)中，與單糖、多胺等小分子物質(zhì)結(jié)合呈易溶態(tài)；脂溶態(tài)阿魏酸與甾醇等脂溶性物質(zhì)結(jié)合，主要存在于植物表面蠟質(zhì)層中；束縛態(tài)阿魏酸以酯或醚的形式，與多糖、木質(zhì)素等細(xì)胞壁物質(zhì)相結(jié)合。阿魏酸是廣泛存在于植物界的一種酚酸，在當(dāng)歸、川芎等中藥材中含量豐富，在咖啡、谷殼、玉米皮之中也含量較高。阿魏酸為當(dāng)歸、川芎等中藥材的主要活性成分，中國(guó)藥典將其作為這些藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。

阿魏酸廣泛用于藥品、食品、化妝品，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制研究，具有重要的學(xué)術(shù)意義與應(yīng)用指導(dǎo)作用。PB路徑是阿魏酸、木質(zhì)素、桂皮酸、查耳酮等藥效成分合成與降解的主要網(wǎng)絡(luò)。與阿魏酸代謝密切相關(guān)的PB子路徑主要有2條：由苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、桂皮酸-4-羥化酶(C4H)合成咖啡酸和阿魏酸，阿魏酸又可經(jīng)阿魏酸-5-羥化酶(F5H)代謝成5-羥阿魏酸[14-15]；阿魏酸經(jīng)4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)、桂皮酰-輔酶A還原酶(CCR)等作用，生成松伯醛和松伯醇，最終生成木質(zhì)素[15-17]。第一條路徑可生成咖啡酸和阿魏酸等活性物質(zhì)，咖啡酸具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，阿魏酸具有抗血栓等作用；第二條路徑產(chǎn)生松伯醛、木質(zhì)素等無(wú)藥理活性物質(zhì)。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，可抑制PB路徑下游的阿魏酸分解酶，使阿魏酸超量積累而又不增加木質(zhì)素(灰分)含量，進(jìn)而提高當(dāng)歸、川芎等藥用價(jià)值。

4 當(dāng)歸頭與尾轉(zhuǎn)錄組研究處于起步階段

4.1 當(dāng)歸的基因組研究可追溯到當(dāng)歸品種的分子鑒定

2003年，張西玲等[18]通過(guò)測(cè)序技術(shù)建立甘肅當(dāng)歸種子rRNA基因圖譜，揭開(kāi)了基因水平研究當(dāng)歸品質(zhì)及分子藥效作用序幕。于光等[19]用cDNA-AFLP等技術(shù)分析岷歸花蕾與發(fā)芽枝條頂端分生組織中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、山梨醇-6-磷酸脫氫酶等參與岷歸抽薹的分子調(diào)控。閻夢(mèng)穎等[20]利用DNA條形碼trnL-F以及ropC1序列對(duì)當(dāng)歸及其混偽品進(jìn)行鑒別。

4.2 當(dāng)歸頭與尾差異表達(dá)基因已初步揭示

本課題組[21-22]率先采用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)岷縣當(dāng)歸采收期之歸頭與歸尾完成轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較研究，獲取了63585個(gè)當(dāng)歸功能基因序列(unigenes),并發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸頭與尾基因表達(dá)存在明顯差異。通過(guò)與UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastx比對(duì)，發(fā)現(xiàn)已注釋的當(dāng)歸基因序列主要分布于目前研究較深入的葡萄、毛果楊、大豆、苜蓿、擬南芥等7種重要經(jīng)濟(jì)作物中，為闡明栽培當(dāng)歸的起源物種提供了理論依據(jù)。本研究識(shí)別了與當(dāng)歸重要藥效物質(zhì)(阿魏酸、當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸總黃酮等)生物合成相關(guān)的基因序列，初步揭示了與當(dāng)歸補(bǔ)血、活血物質(zhì)及部分代謝路徑調(diào)控相關(guān)的基因序列。該階段性研究成果表明，Illumina HiSeq 2000等轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，可用于探測(cè)諸如當(dāng)歸等基因組研究缺乏物種的功能基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式[21-25]。

4.3 當(dāng)歸不同部位阿魏酸代謝及PB路徑基因群呈時(shí)空表達(dá)性

本課題組研究了采收期當(dāng)歸根的轉(zhuǎn)錄組特性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸根的差異表達(dá)基因與PB路徑相關(guān)，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，采收期當(dāng)歸根部表達(dá)的127、69、70個(gè)unigenes分別映射到PB生物合成、N-聚糖生物合成、黃酮類生物合成等路徑，可能參與阿魏酸、當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸總黃酮的生物合成及代謝調(diào)控[21-22]。雒軍等[25]發(fā)現(xiàn)，PAL酶的編碼基因在當(dāng)歸葉片中的表達(dá)量是當(dāng)歸根部的7.5倍，并對(duì)當(dāng)歸COMT酶編碼基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析[26]。溫隨超等[27]發(fā)現(xiàn)，4CL酶編碼基因在當(dāng)歸幼苗中的表達(dá)具有明顯的時(shí)空表達(dá)性。雖有起步，但當(dāng)歸眾多PB路徑關(guān)鍵酶的基因結(jié)構(gòu)與功能特征仍不清楚，PB等路徑在長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的當(dāng)歸成藥期的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式與調(diào)控規(guī)律亟待闡明；歸頭、歸尾與當(dāng)歸地上等部分的PB路徑基因群動(dòng)態(tài)表達(dá)與調(diào)控模式，及其與藥效成分的動(dòng)態(tài)積累模式交互作用機(jī)制有待揭示。

4.4 當(dāng)歸活性成分代謝及其調(diào)控基因研究有待于進(jìn)一步探索

參與阿魏酸等近100種當(dāng)歸活性成分合成與分解的酶及其基因結(jié)構(gòu)與功能研究，仍處于起步階段[21-22]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)所獲得的大量unigenes仍欠缺完整的基因全長(zhǎng)序列信息，藥效相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的基因調(diào)控及其調(diào)控機(jī)制尚待闡釋，代謝相關(guān)基因與環(huán)境脅迫性、藥材道地性之間的關(guān)聯(lián)性仍需深入研究。僅就轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究而論，本課題組的研究亦不十分完整。眾所周知，岷縣當(dāng)歸成藥期分為莖生長(zhǎng)期、根膨大期和采收期等3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期；在長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的藥效成分積累之中，當(dāng)歸頭與尾連續(xù)發(fā)生復(fù)雜而精巧的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，各時(shí)期均對(duì)阿魏酸等藥效成分代謝產(chǎn)生重要影響。

5 RNA-seq、RACE等轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)有助于當(dāng)歸現(xiàn)代化研究

5.1 RNA-seq等技術(shù)快速引入中醫(yī)藥研究，并不斷取得重要成果

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門(mén)在整體水平上研究基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，是研究細(xì)胞表型和功能的重要手段?；贗llumina HiSeq 2000等高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)賦予了生命科學(xué)研究人員超強(qiáng)的覆蓋度和靈敏性，能夠更加準(zhǔn)確、快速地提供更多的生物體轉(zhuǎn)錄信息,在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛[21-27]。陳士林等[28-31]采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)人參、西洋參、三七、柴胡、天麻、東北紅豆杉、銀杏、喜樹(shù)、丹參等主要藥用植物完成大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)200多個(gè)參與生物堿、萜類、黃酮、酚酸類骨架合成相關(guān)的酶基因，及2000多個(gè)參與上述化合物骨架修飾的修飾酶候選基因。孫同玉等[23]從高通量測(cè)序得到的unigenes基因注釋信息中，挖掘出與赤霉素代謝相關(guān)基因PqGA2ox的編碼區(qū)序列，有助于深入西洋參種子解除休眠的分子機(jī)制。張紹鵬等[32]對(duì)珍稀藥用植物珠子參藥用部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,確定其與三萜皂苷合成代謝相關(guān)的候選基因，對(duì)于闡明人參皂苷合成方式提供了重要的研究基礎(chǔ)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)挖掘藥用植物特有生物合成關(guān)鍵酶的基因，解析其生物合成機(jī)制，已成為當(dāng)前中藥材功能基因研究的發(fā)展趨勢(shì)之一。

5.2 RACE技術(shù)是較為可靠的獲取基因編碼區(qū)序列的實(shí)用技術(shù)

運(yùn)用RNA-seq 等獲得的unigenes通常是小于700 bp的基因片段，而非完整的基因編碼序列。欲從轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果之中獲得完整的基因編碼序列，通?？蛇x擇以下策略：將轉(zhuǎn)錄組的unigene與數(shù)據(jù)庫(kù)中該物種EST序列組裝(電子克隆)；對(duì)于已完成基因組測(cè)序的物種，如擬南芥和水稻，可直接將感興趣的unigene與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，以獲取該基因的全部信息，進(jìn)一步分析其可能的轉(zhuǎn)錄本序列；采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，可有效地延伸unigene所缺的5′端或3′端序列。前兩種方法實(shí)施的前提是，所研究對(duì)象的基因組學(xué)信息豐富的物種。但是，當(dāng)歸、人參等絕大多數(shù)藥用植物屬于非模式物種，基因組與核酸序列信息較少，電子克隆或直接比對(duì)的方法并不適用，RACE技術(shù)則是較為可靠的獲取藥用植物完整的基因編碼區(qū)序列的實(shí)用技術(shù)。

5.3 采用RACE技術(shù)研究中藥活性成分代謝基因業(yè)已取得部分成果

RACE是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5′和3′端的有效方法，由3個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)步驟(反轉(zhuǎn)錄、同聚物加尾和PCR擴(kuò)增)完成，以其簡(jiǎn)單、快速、成功率高、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)而日益受到重視[33]。如劉榮華等[34]采用RACE技術(shù)從苦蕎中獲得C4H基因cDNA克??；劉建福等[35]將RT-PCR和RACE相結(jié)合，對(duì)姜黃PAL基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，為闡明姜黃次生代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制、改善該藥材品質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。

6 結(jié)束語(yǔ)

藥用植物次生代謝物種類繁多、代謝途徑復(fù)雜、相關(guān)基因序列與功能信息非常缺乏。但是充分應(yīng)用RNA-seq、RACE等轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)技術(shù)，有助于捕捉其轉(zhuǎn)錄學(xué)特征，闡釋藥效成分代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定代謝產(chǎn)物生物合成的新基因，從分子遺傳學(xué)層面對(duì)參與生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，進(jìn)一步闡釋藥效成分形成的分子機(jī)制。