巨噬細(xì)胞及其在術(shù)后腹腔粘連中的作用①

趙 敏 楊麗麗 李文林 曾 莉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046)

巨噬細(xì)胞大量存在于人體所有組織中，在監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)局部組織微環(huán)境的過(guò)程中至關(guān)重要，它對(duì)代謝物濃度、基質(zhì)、毒素、氧含量、酸化、滲透度以及與微環(huán)境改變相關(guān)的其他分子成分(如細(xì)胞因子)高度敏感，因此巨噬細(xì)胞的代謝變化可以作為改變組織穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)[1,2]。活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、趨化因子和酶，并表現(xiàn)出多種及與之相互矛盾的功能，包括促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)、組織修復(fù)和破壞，以及殺死腫瘤、促血管生成和促腫瘤發(fā)生[3,4]。巨噬細(xì)胞的功能可塑性與極化激活狀態(tài)密切相關(guān)，它通常極化為兩個(gè)主要極端，即經(jīng)典激活導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞(M1)和替代激活導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞(M2)。細(xì)胞因子和介體表達(dá)譜可用于評(píng)估巨噬細(xì)胞是否分化為宿主防御期的促炎性M1表型，或者是主要參與下調(diào)炎癥、促進(jìn)傷口修復(fù)和吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞和細(xì)胞碎片的M2表型[5]。巨噬細(xì)胞在不同的組織器官中有不同的名稱(chēng)，與腹腔粘連關(guān)系最密切的是腹膜腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞，稱(chēng)為腹腔巨噬細(xì)胞[6]。本文將主要闡述巨噬細(xì)胞的相關(guān)信息及巨噬細(xì)胞對(duì)術(shù)后腹腔粘連形成的影響。

1 M1/M2巨噬細(xì)胞的激活與特征性標(biāo)記物

巨噬細(xì)胞表型參與疾病意味著檢測(cè)或調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞反應(yīng)對(duì)于診斷和(或)治療疾病意義重大。目前在體外實(shí)驗(yàn)中，多使用LPS和IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M0型至M1型，IFN-γ的濃度為20 ng/ml[7,8]，LPS的濃度文獻(xiàn)報(bào)道不一，分別可見(jiàn)10 ng/ml[9]、100 ng/ml[7,8]、1 μg/ml[10]和10 μg/ml[11]；IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M0型至M2型，常用濃度為20 ng/ml[12,13]。它們的誘導(dǎo)途徑和受控的生物過(guò)程都不是簡(jiǎn)單模式，并且在環(huán)境變化時(shí)極化狀態(tài)是可逆的[14]。更好地了解巨噬細(xì)胞不同亞型以及巨噬細(xì)胞表型可靠標(biāo)記物的相關(guān)分子途徑和轉(zhuǎn)錄程序，對(duì)于巨噬細(xì)胞領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展是十分必需的。針對(duì)巨噬細(xì)胞極化表型特異性標(biāo)記物的研究，Jablonski等[7]完成了M1和M2巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析并且驗(yàn)證了相關(guān)的M1和M2標(biāo)記物，CD38、Fpr2、Gpr18可用于LPS+IFN-γ誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記，c-Myc和Egr2可用于IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記，皆?xún)?yōu)于傳統(tǒng)的iNos、Arg-1、CD206；另有研究表明CD68或CD163結(jié)合pSTAT1或RBP-J可用于鑒定M1極化巨噬細(xì)胞，而結(jié)合CMAF可用于鑒定M2巨噬細(xì)胞，CD163不是M2特異性標(biāo)記[15]。

2 巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控

巨噬細(xì)胞在功能上非常復(fù)雜，幾乎涉及生命的各個(gè)方面，從免疫和宿主防御到體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和發(fā)育。為了適應(yīng)這種情況，巨噬細(xì)胞形成了不同的極化狀態(tài)。了解它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表型異質(zhì)性是必要的，因?yàn)榫奘杉?xì)胞在許多疾病中是至關(guān)重要的，并且已成為很有吸引力的治療靶標(biāo)。多種基質(zhì)相互作用從而調(diào)控巨噬細(xì)胞的可塑化和極化狀態(tài)，如應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、表觀(guān)遺傳機(jī)制及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、代謝變化等[16,17]。

2.1應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 數(shù)據(jù)表明M1/M2極化狀態(tài)可以被復(fù)雜和相互作用的內(nèi)源性細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其調(diào)節(jié)劑快速誘導(dǎo)和完全逆轉(zhuǎn)或重新極化[18]。

關(guān)于急性應(yīng)激信號(hào)相關(guān)的巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)。在局部環(huán)境中任何形式的損傷都可以誘導(dǎo)炎癥信號(hào)的產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞感知這些變化并整合這些新的應(yīng)激信號(hào)以改變它們的整體轉(zhuǎn)錄程序，從而改變它們的生物效應(yīng)器[19]?，F(xiàn)在研究較多的是ERK1/2-PPAR-γ通路[20]、PI3K/Akt通路[21]、JNK通路[22]、Notch 通路[23]、JAK/STAT通路[24]等。

關(guān)于慢性應(yīng)激相關(guān)的巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)。在慢性炎癥過(guò)程中，其特征是在微環(huán)境中長(zhǎng)期存在非生理信號(hào)[25]，這些信號(hào)通常比急性應(yīng)激反應(yīng)時(shí)弱得多，并且它的激活與營(yíng)養(yǎng)素的非生理攝取有關(guān)，特別是碳水化合物、鹽、膽固醇和游離脂肪酸[26]。

2.2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié) 特定轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)特定基因的表達(dá)，決定巨噬細(xì)胞的功能極化，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transduction and activator of transcription，STAT)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白、干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factors,IRFs)、Kruppel樣因子、GATA結(jié)合蛋白3、NF-κB和c-MYC[27,28]。這些轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)微小RNA(miRNA)調(diào)節(jié)，miRNA是一組小的非編碼RNA，其通過(guò)翻譯抑制或mRNA降解調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以此調(diào)節(jié)響應(yīng)微環(huán)境信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)控制巨噬細(xì)胞的極化[29]。例如，Ⅰ型干擾素可以激活STAT1，并有助于誘導(dǎo)M1相關(guān)基因表達(dá)，如iNOS；IRF5促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，IRF4促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化[30,31];M2極化表型突變的完全缺失包括IL-4、IL-13、IL-4R、STAT6以及控制M2基因表達(dá)的關(guān)鍵下游轉(zhuǎn)錄因子：IRF4、JMJD3、PPARδ和PPARγ,在編碼這些因子的任何基因中，功能缺失等位基因?qū)е翸2極化基因表達(dá)的全部或大量喪失或M2巨噬細(xì)胞的明顯喪失;同時(shí)NF-κB也參與巨噬細(xì)胞極化過(guò)程，但是不同的NF-κB亞基(如c-Rel或p65)在極化中的確切作用并沒(méi)有通過(guò)研究缺乏這些蛋白的巨噬細(xì)胞得到證明[32]。

2.3表觀(guān)遺傳機(jī)制及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié) 表觀(guān)遺傳機(jī)制越來(lái)越被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞表型的關(guān)鍵調(diào)控者。表觀(guān)遺傳過(guò)程是指通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化密集的異染色質(zhì)進(jìn)入轉(zhuǎn)錄因子可及的常染色質(zhì)來(lái)改變基因表達(dá)，但并沒(méi)有影響DNA序列本身。雖然DNA甲基化通常導(dǎo)致基因沉默，但組蛋白修飾可以標(biāo)記開(kāi)放或封閉的狀態(tài)。賴(lài)氨酸(K)殘基的乙?；山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferases，HATs)決定，通常增加轉(zhuǎn)錄活性。HATs的活性可以通過(guò)抑制因子復(fù)合物被抵消，同時(shí)組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)活性去除賴(lài)氨酸乙?；?。通過(guò)組蛋白甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)可以與轉(zhuǎn)錄激活或壓制相關(guān)聯(lián)，這取決于甲基化位點(diǎn)和甲基數(shù)。組蛋白H3在賴(lài)氨酸-4、賴(lài)氨酸-36和賴(lài)氨酸中的二甲基化或三甲基化與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，而H3K9me2/3和H3K27me3被認(rèn)為是抑制性標(biāo)記。這些不同位置的組蛋白甲基化狀態(tài)由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(Histone methyltransferases,HMTs)和相反的組蛋白去甲基化酶(Histone demethylases,HDMS)調(diào)節(jié)。大量的組蛋白修飾酶(Histone-modifying enzymes,HMEs)合作在增強(qiáng)子區(qū)域中設(shè)置所謂的組蛋白密碼，從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化、激活和極化[33]。例如在CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝臟中，PSTPIP2的高甲基化通過(guò)抑制STAT1活性從而抑制M1標(biāo)志物的表達(dá)，并通過(guò)促進(jìn)STAT6活性增強(qiáng)M2標(biāo)志物的表達(dá)。相反，在體外實(shí)驗(yàn)中，敲低PSTPIP2促進(jìn)M1極化并抑制M2極化[34]。

2.4代謝變化 代謝變化在控制巨噬細(xì)胞活化和獲取環(huán)境依賴(lài)性的活性效應(yīng)中也起著重要作用。通過(guò)CD36、脂蛋白脂肪酶和線(xiàn)粒體氧化磷酸化攝取的代謝脂肪酸是IL-4介導(dǎo)的外源性途徑發(fā)育和活化的M2巨噬細(xì)胞所必需的[35]。相比之下，M1巨噬細(xì)胞是通過(guò)糖酵解的[36]。驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞活化的信號(hào)影響代謝途徑，協(xié)調(diào)控制巨噬細(xì)胞的活化和代謝。例如，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)和蛋白激酶B(Akt)整合到JAK-STAT或TLR4信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)， mTORC1和Akt能夠與信號(hào)通路共同作用，確保巨噬細(xì)胞活化和活性效應(yīng)的執(zhí)行[37]。

3 巨噬細(xì)胞與術(shù)后腹腔粘連

腹腔粘連是指通常在大網(wǎng)膜、腸袢、內(nèi)臟和腹壁之間形成的病理性“連接”。 它們的存在形式從細(xì)小的無(wú)血管的薄膜到可能包含血管和神經(jīng)結(jié)構(gòu)的實(shí)際結(jié)締組織橋，或者鄰近器官之間的直接粘連接觸。腹膜在經(jīng)過(guò)手術(shù)、感染、外傷或輻射繼發(fā)的任何干擾后，都可能導(dǎo)致腹部組織的損傷和炎癥。通過(guò)浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞和氧化應(yīng)激釋放的細(xì)胞因子被認(rèn)為是導(dǎo)致粘連形成的觸發(fā)機(jī)制和初始步驟；細(xì)胞外基質(zhì)的沉積導(dǎo)致后期纖維蛋白溶解失衡并促進(jìn)粘連的形成[38]。因此，粘連形成過(guò)程簡(jiǎn)要描述如下：涉及腹膜的組織損傷引起炎癥和纖維蛋白沉積，其將受損組織連接到相對(duì)器官[39,40]。

一旦經(jīng)歷手術(shù)操作，即會(huì)啟動(dòng)復(fù)雜的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致駐留巨噬細(xì)胞的募集和激活[41]。巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和NKT細(xì)胞以及IgE和選定的IgG亞類(lèi)相互作用，共同影響著炎癥、血管生成、細(xì)胞募集和肌成纖維細(xì)胞的膠原蛋白沉積[42]。巨噬細(xì)胞是一種動(dòng)態(tài)和功能異質(zhì)的細(xì)胞群，組織學(xué)數(shù)據(jù)顯示巨噬細(xì)胞在粘連形成早期就存在[43]，它們不同極化狀態(tài)所占的細(xì)胞比例在腹腔粘連的發(fā)生和/或修復(fù)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。以下從炎癥和膠原蛋白沉積方面闡述巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)在腹腔粘連形成過(guò)程中的作用。

3.1炎癥 在粘連組織中可以觀(guān)察到大量的單核圓形細(xì)胞浸潤(rùn)，這些細(xì)胞被鑒定為巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞[44]。巨噬細(xì)胞是先天免疫細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，充當(dāng)急性和慢性炎癥的細(xì)胞介質(zhì)，并且是炎癥起始、持續(xù)和消退的關(guān)鍵細(xì)胞[45-47]。經(jīng)典活化的M1巨噬細(xì)胞與引發(fā)和維持炎癥有關(guān)，M2或M2樣巨噬細(xì)胞與消退慢性炎癥有關(guān)[48]。在粘連組織和M1型巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的水平，如TNF-α、IL-6和INF-γ升高，但在某種程度上也存在于M2表型內(nèi)，M2表型改變后細(xì)胞因子和標(biāo)記物也發(fā)生變化，如CD206、YM1和Arg-1等[40]。M2表型的驅(qū)動(dòng)因子包括Th2衍生的IL-4、IL-10和PPAR-γ，PPAR-γ是一種具有強(qiáng)效抗炎作用的配體激活的核受體[49]。一項(xiàng)研究表明，內(nèi)源性巨噬細(xì)胞特異性PPAR-γ信號(hào)傳導(dǎo)影響精氨酸酶活性和巨噬細(xì)胞極化，并且反向調(diào)節(jié)腹膜粘連情況。藥理性的PPAR-γ激動(dòng)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化，并以巨噬細(xì)胞依賴(lài)的方式改善粘連[40]。

3.2纖維蛋白沉積 在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后滲出液中的巨噬細(xì)胞在腹膜創(chuàng)傷愈合期間的纖溶過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能是通過(guò)產(chǎn)生和分泌纖溶酶原激活物(uPA和tPA)和纖溶酶原激活抑制劑(PAI-1和PAI-2)以及TNF、EGF等其他物質(zhì)[50]。EGF促腹膜間皮細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)其向成纖維細(xì)胞表型改變，還能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移和細(xì)胞外基質(zhì)分子的粘附[51,52]。纖維蛋白原在腹膜創(chuàng)傷后釋放，可能影響腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)模式，從而降低巨噬細(xì)胞的纖維蛋白溶解活性，這可能使粘連持續(xù)存在[53]。活化M1巨噬細(xì)胞分泌許多炎癥細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)[54]。TGF-β1在損傷和隨后的炎癥和纖維化之間起著橋梁作用，它可以破壞腹膜損傷后纖維蛋白形成與降解的平衡，進(jìn)而引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，為粘附形成提供基礎(chǔ)[55]。Ar′Rajab等也發(fā)現(xiàn)蛋白酶胨對(duì)M2型腹腔巨噬細(xì)胞的增強(qiáng)及巨噬細(xì)胞移植到非增強(qiáng)的巨噬細(xì)胞腹膜中都降低了術(shù)后粘連形成的程度[56]。粘連形成的程度與M2標(biāo)記表達(dá)成反比，在粘連形成過(guò)程中，通過(guò)改變巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，可以調(diào)節(jié)此過(guò)程[57]。M2巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的Arg-1可以減少肝纖維化和膠原沉積[58]。Pesce等[59]假設(shè)巨噬細(xì)胞內(nèi)的精氨酸酶活性與成纖維細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)膠原產(chǎn)生的底物L(fēng)-精氨酸，導(dǎo)致膠原產(chǎn)生減少。

4 結(jié)語(yǔ)

以上研究表明巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)腹腔粘連形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是目前它影響的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。更成功地預(yù)防粘連技術(shù)很可能是從深入了解細(xì)胞、分子誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)粘連形成及修復(fù)的機(jī)制發(fā)展而來(lái)的。因此，不斷探尋巨噬細(xì)胞在腹腔粘連發(fā)展的作用是十分必要的，希冀在圍手術(shù)期從巨噬細(xì)胞層面能夠制定防治腹部手術(shù)后粘連形成的有效策略。