濾泡輔助性T細胞(Tfh)在乳腺癌中的作用①

馬林曉曦 張曉明 吳 炅

(復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，上海市乳腺腫瘤重點實驗室，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032)

T淋巴細胞在機體免疫應答中發(fā)揮重要作用。按照表面標志物和功能，可將其分類，主要有：①CD4+輔助性T細胞(helper T cell,Th)：通過協(xié)助其他免疫細胞發(fā)揮免疫應答功能；② CD4+調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)：特異性表達轉錄因子Foxp3，通過負調控機體免疫反應，維持自身免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定；③ CD8+細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)：通過特異性殺傷靶細胞，在抗感染和抗腫瘤免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。

按照分泌細胞因子的不同，Th細胞可進一步劃分為Th1、Th2、Th17等亞群。濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cell,Tfh)是一類特殊的Th細胞，以程序性死亡受體1(Programmed cell death protein 1,PD-1)、CXC趨化因子受體5(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5)、可誘導協(xié)同刺激分子(Inducible co-stimulator,ICOS)、B細胞淋巴瘤6蛋白(B cell lymphoma 6 protein,Bcl-6)、CXC趨化因子配體13(C-X-C motif chemokine ligand 13,CXCL13)、白細胞介素21(Interleukin 21,IL-21)為主要標志物，近年來引起許多科學家的重視。現(xiàn)有研究表明，Tfh細胞或類Tfh細胞(Tfh-like cell)的浸潤與自身免疫疾病、獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)及乳腺癌等多種腫瘤的預后相關[1-6]。本文總結了Tfh細胞的分布和功能，主要對乳腺癌中Tfh細胞的表型、功能以及在預后價值做一綜述，以闡述Tfh細胞在乳腺癌中的作用。

1 Tfh細胞的定位及功能

Tfh細胞最初發(fā)現(xiàn)于人類扁桃體，是一群高表達CXCR5的CD4+T細胞[7]。研究發(fā)現(xiàn)，健康人外周血中也存在CD4+CXCR5+T細胞，這群細胞在CXCL13的趨化作用下，遷移至B淋巴濾泡，因此Tfh細胞正常狀態(tài)下主要定位于淋巴組織，協(xié)助B細胞執(zhí)行功能。Tfh細胞同時高表達PD-1、ICOS、Bcl-6，分泌IL-21，參與調控B細胞的活化、抗體類型轉換以及生發(fā)中心的形成[8,9]。位于生發(fā)中心的Tfh細胞通過分泌CXCL13，介導特定T細胞以及B細胞的遷移，實現(xiàn)對B細胞增殖分化的調節(jié)[1,10]。Tfh細胞通過表達核心轉錄因子Bcl-6，可抑制其他Th細胞亞群的分化。Tfh細胞表面標志物和細胞因子的表達有別于已有研究的Th1、Th2、Th17等Th細胞亞群，而其在疾病狀態(tài)下的表達差異也受到廣泛關注。

2 免疫細胞的檢測方法

Tfh細胞作為一種免疫細胞，其研究方法與其他免疫細胞類似。目前對免疫細胞的研究，主要分為定位、定量及定性實驗。下文以T細胞為例，概述免疫細胞狀態(tài)和功能的常用研究方法。

2.1 流式細胞術 流式細胞術(Flow cytometry,FCM)是一種對液流中排成單列的細胞或其他生物微粒進行快速定量檢測的技術，也是目前免疫細胞研究的重要方法。如由乳腺癌組織或外周血制成的細胞懸液，流式細胞儀可根據(jù)細胞性質和表面抗原的不同，對T淋巴細胞亞群進行進一步劃分。按照細胞處理方式的不同，既可以分析表面標志物，也可以測定細胞因子的表達或測定功能指標，進行定量及定性研究[11]。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗及熒光定量PCR 酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是利用抗原抗體的特異性結合進行定量檢測的方法，可以直接檢測細胞因子，也可以測定細胞培養(yǎng)液中細胞因子的水平。由于ELISA無法檢測混合體系中單一細胞的信息，在研究特定細胞功能時，可首先利用FCM分選出單一細胞再利用ELISA檢測[12]。

除了利用FCM或者ELISA對細胞因子進行測定，也可利用各種印跡法、斑點雜交、原位雜交和聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)等技術來檢測細胞因子的DNA或RNA。其中實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)基本不需要任何的體外刺激步驟，是一種非常敏感的細胞因子檢測技術[12]。

2.3 免疫組化 免疫組化是研究淋巴細胞的經(jīng)典方法，即利用組織標本和細胞標本制片，通過抗原抗體反應來顯示組織內(nèi)相應細胞的表達情況。按照標記物的種類，主要有免疫熒光細胞技術、免疫酶細胞化學技術、免疫膠體金技術等。免疫組化技術除了可以實現(xiàn)對淋巴細胞的定位，還可以定量研究。受限于細胞亞群表面標志物的共表達，傳統(tǒng)的免疫組化技術可同時研究的免疫細胞種類非常有限，但是多色免疫熒光技術的出現(xiàn)，拓寬了免疫組化在免疫細胞領域的應用前景。如利用乳腺癌石蠟切片，多色免疫熒光技術可以通過同一張切片上多種抗體的共表達來確定T細胞亞群，實現(xiàn)組織原位觀察，進行組織原位類流式分析[3,13]。

3 Tfh細胞在乳腺癌中的表型

Tfh細胞是機體免疫反應特別是體液免疫應答的重要調節(jié)因素，在AIDS、自身免疫性疾病中存在特殊意義[2,6,14]。同時，越來越多證據(jù)顯示，Tfh細胞標志物的表達與多種癌癥相關[1,3]。然而，不同于生發(fā)中心以PD-1hiCXCR5+ICOS+Bcl-6+IL-21+CXCL13+為特征的Tfh細胞，乳腺癌組織中的Tfh細胞表型呈現(xiàn)為PD-1hiCXCR5-ICOSintBcl-6int，同時分泌IL-21、CXCL13[1,13]。同樣有證據(jù)顯示，肝癌中Tfh細胞表面標志物與正常Tfh細胞不同，主要以PD-1lo/-CXCR5-BTLA-CD69hi為代表，并分泌IL-21[3]。為區(qū)別于正常淋巴組織中的Tfh細胞，有研究稱其為Tfh-like細胞。證據(jù)顯示，乳腺癌Tfh-like細胞除上述特征外，大多呈CD45RA-，并且存在CD200hiTIGIThiFAShiCTLA-4+CCR7-的表達，而基因水平高表達CXCL13、IL-21、IFNG、TBX21、BCL6，低表達FOXP3[1]。在乳腺癌腫瘤引流淋巴結(Tumor draining lymph node,TDLN)中，則存在CXCR5+Bcl-6+Foxp3-的CD4+T細胞，被認為是Tfh細胞[15]。

這些標志物的表達差異，意味著癌癥狀態(tài)下免疫調控的改變，有望在其中為疾病的診斷和治療尋找新的作用靶點。以下簡述這些細胞分子標志物的背景及其在腫瘤中的研究進展。

3.1 PD-1 PD-1是一種重要的免疫抑制分子，屬于CD28超家族，主要表達于T細胞、B細胞和骨髓細胞，并且在活化的T細胞上表達上調。在自身免疫性疾病、慢性感染、腫瘤等疾病中，PD-1存在異常表達，近年來已成為免疫學研究的熱點。針對PD-1的靶向治療可以提高T細胞的反應活性，并在黑色素瘤、非小細胞性肺癌、腎細胞癌等多種腫瘤中有效[16-19]。

研究顯示，乳腺癌組織中PD-1高表達的CD8+T細胞的數(shù)量與預后相關[20]。而同樣有研究證實，乳腺癌中CXCL13+CD4+T細胞的PD-1及T細胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin and mucin 3,Tim-3)表達上調，而這類前文中提到的Tfh-like細胞對B細胞的調控能力下降[21]。

3.2 CXCR5 CXCR5是趨化因子受體CXC受體家族的一員，也被稱為Burkitt淋巴瘤受體1(Burkitt′s lymphoma receptor 1,BLR-1)，主要表達于成熟B細胞，而在T細胞中只有Tfh細胞持續(xù)高表達CXCR5。正常情況下，在配體趨化因子CXCL13的趨化作用下，CXCR5+的Tfh細胞遷移至淋巴濾泡中心，與B細胞共定位，進而發(fā)生相互作用。

而在乳腺癌組織中，Tfh-like細胞多為CXCR5-，可能是在Tfh細胞由生發(fā)中心遷移到腫瘤組織的過程中，由于腫瘤組織微環(huán)境的影響，呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，使得Tfh細胞的CXCR5表達下調[1,13,22]。關于乳腺癌TDLN的研究提示，其中存在兩種表達CXCR5的CD4+T細胞，分別是以Bcl-6+CXCR5+Foxp3-為特征的Tfh細胞和以Bcl-6+CXCR5hi/intFoxp3+為特征的濾泡調節(jié)性T細胞(T follicular regulatory cells,Tfr)[15]。源于初始Treg細胞的Tfr細胞對Tfh細胞起到抑制作用，并可能通過CXCR5的表達來限制生發(fā)中心反應以及自身抗體的產(chǎn)生[23,24]。

3.3 CXCL13 CXCL13是CXCR5的特異性配體，又被稱為B細胞吸附因子1(B-cell attracting chemokine 1,BAC-1)或B細胞趨化因子(B lymphocyte chemoattractant,BLC)，是近年來的研究熱點，包括神經(jīng)性疼痛也與CXCL13及其受體CXCR5有關[25]。CXCL13可以發(fā)揮趨化作用，吸引B細胞，進而調控B細胞在體內(nèi)的定位、成熟和分化。

Gu-Trantien等[13,22]研究CD4+腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TILs)時發(fā)現(xiàn)，CXCL13基因的高表達在乳腺癌中提示更高的無病生存(Disease free survival,DFS)，多因素Cox分析顯示，CXCL13是乳腺癌的獨立預后因素。研究者以PD-1hiCD200hi為特征界定乳腺癌CD4+TILs中的Tfh細胞，由于CXCL13的表達與之明確相關，進一步將CXCL13+表達的Tfh細胞定義為TfhX13細胞，并認為這群細胞可能在乳腺癌微環(huán)境的體液免疫應答中起關鍵作用[13,22]。

3.4 ICOS ICOS是CD28家族成員，表達于活化的T細胞。其配體為ICOSL，表達于B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，并在細胞活化狀態(tài)下表達上調。ICOS是Tfh細胞發(fā)揮功能的重要分子，ICOS缺失會導致B細胞成熟障礙、抗體類型轉換受阻[26,27]。ICOS敲除的小鼠，IL-21分泌能力下降，影響Tfh細胞的增殖和分化[28]。而B細胞分泌的ICOSL可以通過介導非典型NF-κB信號通路，調節(jié)Tfh細胞的分化[29]。

對乳腺癌組織TILs的研究表明，Tfh細胞ICOS呈中等程度表達[13]。該研究同時關注PD-1及ICOS的表達情況，實驗顯示，PD-1及ICOS可將CD4+TILs分為PD-1loICOSlo、PD-1hiICOSint、PD-1intICOShi三群。Tfh細胞呈PD-1hiICOSint表達，而PD-1intICOShi群同時有Foxp3高表達，故認為是活化的Treg細胞，發(fā)揮免疫抑制功能。

3.5 Bcl-6 Tfh細胞作為機體免疫調控的重要影響因素，其形成過程復雜。正常情況下，Bcl-6和CXCR5表達上調、ICOS信號激活等過程共同完成T細胞向Tfh細胞的分化[30]。B淋巴細胞誘導成熟蛋白1(B lymphocyte induced maturation protein 1,Blimp-1)是Tfh細胞分化的負調控分子，在Treg細胞和其他Th細胞中高表達[31]。轉錄因子Bcl-6可通過抑制Blimp-1協(xié)助Tfh細胞的形成，Blimp-1與Bcl-6間的表達水平是影響CD4+T細胞分化的重要決定因素[32,33]。亮氨酸鏈狀轉錄因子(Basic leucine zipper transcription factor,ATF-like,BATF)是Bcl-6的直接調控分子，因而在Tfh細胞分化、生發(fā)中心形成及體液免疫中都有重要作用[34]。Mcdonald等[35]還就細胞因子對Bcl-6的影響進行研究，指出白細胞介素6(Interleukin 6,IL-6)可以使Bcl-6與CXCR5表達上調，IL-7則起抑制作用。Mathew等[36]發(fā)現(xiàn)介導E3泛素連接酶復合物組裝的連接蛋白家族成員Cul3是Bcl-6的關鍵整合因子，Bcl-6-Cul3復合體通過發(fā)揮在T細胞活化和分化過程的負反饋調節(jié)作用，以限制Tfh細胞的過度分化。

目前認為生發(fā)中心的Tfh細胞表達PD-1、CXCR5、ICOS和Bcl-6，而血液中呈CXCR5+的Tfh細胞，本質上是生發(fā)中心產(chǎn)生的循環(huán)記憶Tfh細胞，以Bcl-6、PD-1、ICOS表達下調為特征。調節(jié)Th細胞向Th1細胞分化的轉錄因子T-bet(T-box expressed in T cell)在乳腺癌組織Tfh-like細胞中表達上調，而誘導Th細胞向Tfh細胞分化的轉錄因子Bcl-6呈中等程度表達[1]。在乳腺癌TDLN中，F(xiàn)aghih等[15]的研究提示，Bcl-6可以作為界定Tfh細胞的標志之一，但必須聯(lián)合Foxp3，以區(qū)別同樣呈Bcl-6+的Tfr細胞[24]。

3.6 IL-21 IL-21由Tfh細胞分泌，也是Tfh細胞的特征性細胞因子。IL-21主要通過誘導Tfh細胞分化，以自分泌的形式促進Tfh細胞表達CXCR5以及誘導Tfh細胞表達ICOS，調節(jié)Tfh細胞分化和遷移，輔助Tfh細胞調控B細胞功能[37]。IL-21的缺失會造成生發(fā)中心B細胞成熟障礙和漿細胞存活下降[38]。干擾素調節(jié)因子4(Interferon regulatory factor 4,IRF4)和信號轉導與轉錄因子3(Signal transduction and transcription factor 3,STAT3)協(xié)同作用，可以間接使得IL-21分泌增多[39]。IL-21和白細胞介素4(Interleukin 4,IL-4)信號相互作用，影響體液免疫應答。Tfh分泌IL-21啟動高親和力抗體選擇，而IL-4的分泌輔助漿細胞分化，產(chǎn)生抗體[40]。二者同時缺失，會損害生發(fā)中心的形成以及抗體應答[41]。

qPCR顯示乳腺癌組織Tfh-like細胞有IL21基因高表達[13]。然而Zhu等[21]發(fā)現(xiàn)，若細胞同時有Tim-3表達，其分泌IL-21能力下降。盡管尚未有研究闡述乳腺癌TDLN中IL-21的分泌情況，但以IL-4+為特征的Th2細胞在TDLN中的表達與Tfh細胞呈正相關，提示Th2細胞可能與Tfh細胞在抗體應答中有協(xié)同作用[15]。

4 Tfh細胞在乳腺癌中的功能

盡管Tfh細胞在體液免疫中發(fā)揮重要的免疫調節(jié)功能，但目前有關乳腺癌Tfh細胞的研究報道很少且尚不深入。Gu-Trantien等[1]將乳腺癌組織中的Tfh-like細胞與B細胞共同分析，結果提示Tfh-like細胞分泌的重要細胞因子CXCL13與B細胞密切相關。FCM分析表明，CXCL13+TILs與CXCR5+B TILs相關，且Tfh-like細胞高表達的TILs與有Ki-67表達的B TILs相關。共聚焦顯微技術說明，CXCL13+TILs可與向瘤床遷移的B細胞共定位，可能負責乳腺癌組織B TILs的招募以及三級淋巴樣結構的形成。Faghih等[15]收集了47例乳腺癌患者的淋巴結標本以研究乳腺癌TDLN中CD4+淋巴細胞的表達譜，結果顯示，其中30%有不同程度的癌轉移。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，對于淋巴結受累與未見淋巴結受累的患者，Tfh細胞比例無明顯差異。除前文中提到的Th2細胞，Tfh細胞比例還與CD25+Treg細胞和Tfr細胞呈正相關，這表明Tfh細胞的分化和B細胞功能的實現(xiàn)可能受到CD25+Treg細胞和Tfr細胞調控[15,23,24]。

Tfh細胞主要通過表面分子及其分泌的細胞因子行使功能，然而這些標志物的表達在不同狀態(tài)下存在差異。體外實驗證實，乳腺癌Tfh細胞經(jīng)過刺激后，Tim-3高表達的細胞相對于Tim-3低表達的細胞而言，分泌細胞因子CXCL13、IL-21的能力及自身增殖活性較低，從而將Tim-3+定義為耗竭的Tfh細胞的標志[21]。同時共培養(yǎng)實驗提示，這群耗竭的Tfh細胞會導致B細胞分泌免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的能力下降，弱化Tfh細胞對體液免疫應答的調節(jié)能力[21]。

5 Tfh細胞對乳腺癌預后的預測作用

分泌CXCL13的Tfh-like細胞在三陰性乳腺癌以及組織學分級3級的乳腺癌中表達上升[1]，其相關基因對乳腺癌的預后有預測作用。有研究分析與Tfh相關的基因，發(fā)現(xiàn)CD200、CXCL13、FLJ37440、ICOS、SGPP2、SH2D1A、VSTM3及PDCD1對乳腺癌生存有預測作用。這8個基因聯(lián)合組成Tfh信號預測乳腺癌預后，高表達的Tfh信號提示更高的無病生存率(Disease ftee survival，DFS)。按照雌激素受體(Estrogen receptor,ER)和人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor 2,Her2)的表達情況對乳腺癌患者進行分型，發(fā)現(xiàn)上述結論在所有分型的乳腺癌患者以及Her2+或ER+Her2-的乳腺癌患者中均有意義[22]。

乳腺癌組織中檢測到的CXCL13主要由Tfh TILs分泌，對乳腺癌的預后也有重要的預測價值。CXCL13基因是乳腺癌預后預測的獨立影響因素。CXCL13高表達，提示患者DFS更高。這一結論同樣在所有分型的乳腺癌患者以及Her2+或ER+Her2-的乳腺癌患者中均有意義，特別是對于Her2+乳腺癌患者。然而對于ER-Her2-的患者，CXCL13基因表達及由多個基因聯(lián)合而成的Tfh信號表達尚未證實與預后相關[1,22]。

6 小結

Tfh細胞通過表面標志物的表達以及細胞因子的分泌，調節(jié)B細胞的增殖分化，輔助B細胞完成體液免疫應答，是一類重要的免疫細胞。Tfh細胞在多種疾病中發(fā)生變化，也存在于多種腫瘤組織中，是構成腫瘤微環(huán)境的一個重要組成部分。在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)的Tfh細胞的表面標志物不同于生發(fā)中心的Tfh，目前對于此類細胞在乳腺癌發(fā)生發(fā)展和預后中的作用尚不完全清楚，特別是乳腺癌有多種分子亞型，加大了研究的復雜度。對乳腺癌Tfh細胞的進一步研究將有助于加深對乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境的認識，發(fā)現(xiàn)潛在的免疫治療靶點，為難治型乳腺癌的治療帶來新的思路。