循環(huán)微小RNA-1 診療心肌梗死的研究進展

蘇彤、張曉璞、李勛綜述，楊承健審校

我國心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，心血管死亡率高居首位。其中心肌梗死發(fā)病急而兇險，病死率高，2002～2015 年急性心肌梗死死亡率總體呈上升態(tài)勢，早期診療對改善預(yù)后十分重要[1-2]。近年來研究了各種早期診斷心肌梗死新的生物學(xué)標(biāo)志物以及治療靶點，其中包括非編碼RNAs（NcRNAs），即一類高度保守，通常情況下不編碼蛋白質(zhì)但在功能上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達的RNA 分子[3]。目前推測這些非編碼轉(zhuǎn)錄物是生理和病理條件下基因表達的關(guān)鍵調(diào)控者，根據(jù)轉(zhuǎn)錄物長度將NcRNAs 分為短鏈、中鏈、長鏈以及環(huán)狀RNAs，其中被廣泛研究的、與心肌梗死相關(guān)的NcRNAs 是microRNAs（miRNAs，miRs）。

miRs 是一類調(diào)控基因表達、高度保守的非編碼短鏈RNA（21～24 nt），參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，并且在健康者和各種疾病患者表達譜存在明顯差異，同時穩(wěn)定存在于外周血中，具備診療心肌梗死的潛力[4]。miR-1 存在心肌細胞表達特異性，是首個發(fā)現(xiàn)與心血管發(fā)展相關(guān)的miRs。miR-1 家族包括miR-1 亞家族和miR-206，miR-1 亞家族包括了miR-1-1 和miR-1-2 兩個轉(zhuǎn)錄本。在人類，這兩個轉(zhuǎn)錄本的成熟產(chǎn)物相同，具有共同序列，但其基因分別定位于2 號染色體和18 號染色體，故miR-1 亞家族表達于心肌和骨骼肌細胞，而miR-206 只表達于骨骼肌細胞。近年來，多項研究提示miR-1 直接參與調(diào)控了心肌梗死的整個病理過程，通過檢測miR-1 的表達量變化以及上游調(diào)節(jié)有助于改善心肌梗死預(yù)后[5-7]。

1 診斷心肌梗死

目前，臨床上診斷心肌梗死主要依靠患者臨床表現(xiàn)以及心電圖（ECG）動態(tài)改變，當(dāng)二者出現(xiàn)診斷困難時，需聯(lián)合以肌鈣蛋白（cTn）為代表的生物學(xué)標(biāo)志物，目前cTn 仍是診斷心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但cTn 一般在心肌梗死發(fā)病3 h 左右才開始升高，24 h 左右達到峰值，并且在發(fā)生主動脈夾層、腎功能衰竭終末期、肺栓塞、急性心力衰竭時同樣升高，此時若存在冠狀動脈造影禁忌證或患者及家屬拒絕有創(chuàng)診療方式，診治將會非常棘手[8-10]。因此，有必要尋找新的診斷心肌梗死的生物學(xué)標(biāo)志物。優(yōu)秀的標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)滿足以下條件：獲取方法較易，如血液和尿液；具備心臟特異性；正常情況下，在循環(huán)系統(tǒng)中的表達水平很低或檢測不到，并且表達水平應(yīng)與心肌梗死嚴(yán)重程度相關(guān)；如果心肌梗死發(fā)生，標(biāo)志物應(yīng)該在很短的時間內(nèi)從損傷的心肌釋放到血液循環(huán)中，并具有相對較長的半衰期便于檢測。

早期動物研究提示，在大鼠冠狀動脈結(jié)扎1 h后即能檢測到血漿中miR-1 明顯增加，6～12 h 達峰值，24 h 明顯下降，這為早期診斷心肌梗死提供了新思路[11]。Qipshidze Kelm 等[12]通過結(jié)扎不同年齡小鼠冠狀動脈前降支制作心肌梗死動物模型，通過實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測血漿中miR-1 以及miR-133a 含量，研究提示miR-1升高更為明顯，并且年齡較大的小鼠心肌梗死后血漿中miR-1 的含量增加且與心功能減退正相關(guān)。

近年來，有關(guān)miR-1 早期診斷心肌梗死的臨床研究結(jié)果也較多，已有相關(guān)系統(tǒng)評價薈萃分析發(fā)表。李春雨等[13]對2010 年1 月1 日至2015 年11 月20日發(fā)表的中國患者miRs 診斷心肌梗死的24 項研究3 066 例受試者進行了分析。其中主要涉及miR-1、miR-499、miR-208 和miR-133，8篇研究報道了miR-1，采用靈敏度（Sen）、特異度（Spe）、診斷優(yōu)勢比（DOR）、ROC 曲線下面積（AUC）作為評價指標(biāo)，各研究之間異質(zhì)性明顯（P＜0.10，I2=74.8%），合并Sen、Spe、DOR 以 及AUC 分別為0.73（95%CI：0.69～0.78）、0.84（95%CI：0.80～0.87）、24.74（95%CI：9.17～66.77）和0.8374，若miR-1 聯(lián) 合miR-133、miR-499 診斷心肌梗死，診斷效能不俗。

在另一項對亞洲心肌梗死患者展開的系統(tǒng)評價中，檢索了2017 年2 月公開發(fā)表的miRs 診斷心肌梗死的文獻，共納入26 項研究，包括1 973 例心肌梗死患者，1 236 例健康對照組，其中9 項研究涉及miR-1，分析所有涉及miR-1 的研究，提示各研究之間異質(zhì)性明顯（P＜0.10，I2＞50%），合并Sen、Spe、DOR 以及AUC 分別為0.70（95%CI：0.66～0.74，P＜0.05）、0.81（95%CI：0.78～0.85，P＜0.001）、15.20（95%CI：7.48～30.89，P＜0.001）和0.8409，此外，通過Deeks 檢驗評估m(xù)iR-1 的發(fā)表偏倚，結(jié)果表明發(fā)表偏倚可能性較低，同時比較研究較多的miRs，提示miR-499 診斷效能較高[14]。

我們的研究通過收集急性胸痛患者發(fā)病3 h 內(nèi)血漿，根據(jù)診斷結(jié)果分為心肌梗死組與非心肌梗死組，同時納入同期體檢患者作為對照組，通過qRT-PCR 檢測miR-1 含量，并與cTn、肌酸激酶同工酶（CK-MB）比較，發(fā)現(xiàn)心肌梗死組血漿miR-1、cTnI、CK-MB 較非心肌梗死組和對照組升高（P均＜0.001）；心肌梗死患者血漿miR-1 與cTn、CK-MB均呈顯著正相關(guān)（P均＜0.001）；miR-1 的AUC 為0.905（P＜0.001），cTn 的AUC 為0.908（P＜0.001），CK-MB 的AUC 為0.795（P＜0.001），結(jié)果提示血漿miR-1 可早期診斷心肌梗死，診斷效能優(yōu)于CKMB，且與cTn 相當(dāng)，并且可以提供cTn 以外的診斷信息，二者聯(lián)合應(yīng)用可能有助于提高心肌梗死早期診斷的準(zhǔn)確性[15]。

2 治療心肌梗死

心肌梗死可導(dǎo)細胞缺氧，同時激活內(nèi)皮細胞、升高活性氧水平、產(chǎn)生炎性趨化因子及細胞因子，致使炎癥細胞聚集在梗死區(qū)域、損傷心肌，同時激活病理性信號通路導(dǎo)致氧化劑及蛋白水解酶釋放，促使心肌細胞死亡、內(nèi)皮毛細血管損傷及擴大梗死范圍，最后導(dǎo)致心臟重構(gòu)、心肌纖維化等不良結(jié)局[16-17]。發(fā)病黃金時間的再灌注治療目前仍然是首選方案，Varga 等[18]首次證明大鼠血漿miRs表達譜受到缺血再灌注誘導(dǎo)的顯著影響，這表明miRs 參與心臟保護性信號傳導(dǎo)，提示特定的保護性miRs 可作為用于治療缺血再灌注損傷的潛在治療工具。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-1 存在特定的基因調(diào)節(jié)功能，參與干細胞修復(fù)心肌梗死后心肌損傷，是干細胞分化的調(diào)節(jié)器，可以提高移植細胞的存活率，從而提供新的治療靶點[19-21]。

Huang 等[22]通過將豐富表達的miR-1 骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）注入心肌梗死部位，可以提高 BMSCs 生存時間，其機制可能是miR-1 可抑制notch 下游靶基因Hes-1 而促進干細胞分化成心肌細胞，從而提高心肌梗死的心肌修復(fù)和改善心功能，此研究表明miR-1 可能通過調(diào)節(jié)靶基因改善干細胞治療心肌梗死效果。與此同時，相關(guān)研究表明miRs可增加心臟祖細胞（CPCs）增殖，其中miR-1 可在血管生成分化中上調(diào)，抑制Spred1 蛋白，控制生長因子激活，從而對血管生成出現(xiàn)負反饋作用，促使人類心臟祖細胞（hCMPCs）對這些血管生長因子敏感，分化形成新的血管，該研究同時經(jīng)過遷移實驗證實了miR-1 能增加hCMPCs 的能動性[23]。

Izarra 等[24]證實了miR-1 可以抑制基因BIM、BMF 表達，從而抑制心肌細胞凋亡，同時促進CPCs分化。先前有研究證實miR-1 能促進胚胎干細胞（ESCs）向心肌樣細胞分化，通過將轉(zhuǎn)染miR-1 的ESCs 移植至心肌梗死部位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)于僅將ESCs植入心肌細胞，提示miR-1可改善心肌梗死后心功能，因過表達的miR-1 可激活p-Akt 并且抑制Caspase-3、PTEM 以及超氧化物產(chǎn)物從而抑制心肌細胞凋亡，抵抗氧化應(yīng)激，減少心肌損傷[25]。

針對心肌梗死的早期治療以及預(yù)防并發(fā)癥極為關(guān)鍵，心肌梗死發(fā)病早期的死亡原因主要是室性心律失常。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)運輸系統(tǒng)的失調(diào)在心血管疾病的發(fā)展中起著重要的作用，心肌梗死小鼠模型血漿中miR-1 含量明顯升高，促使與細胞內(nèi)運輸相關(guān)的基因Stx6、Braf、Ube3a、Mapk8ip3、Ap1s1、Ccz1、Gja1 下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后小鼠心臟中和缺氧心肌細胞中Stx6 降低，進一步證實Stx6 是miR-1 的靶標(biāo)；相反，Stx6 的過表達減弱了miR-1 或缺氧對PLM 和L 型鈣通道的損傷，表明miR-1 通過調(diào)節(jié)Stx6 參與心肌梗死后缺血性心律失常的發(fā)生，這為miR-1 通過調(diào)節(jié)運輸相關(guān)基因的途徑參與心肌梗死后心律失常提供了新的見解[26]。

已有研究證實縫隙連接蛋白43（Cx43）主要構(gòu)成心室肌細胞的心肌縫隙連接通道，其表達下降可減慢電傳導(dǎo)，延長復(fù)極，減慢傳導(dǎo)速率，導(dǎo)致病理性折返回路，出現(xiàn)各種惡性室性心律失常，尤其是缺血性心律失常，而研究證實下調(diào)miR-1 表達，調(diào)節(jié)其靶基因GJA1、KCNJ2，上調(diào)Cx43 和Kir2.1 蛋白表達，恢復(fù)去極化的靜止膜電位，從而治療快速型心律失常，特別是通過將miR-1 特異性反義寡聚核苷酸（AMO-1）導(dǎo)入缺血心肌后效果顯著[27-30]。Xue等[31]通過以樹突細胞為基礎(chǔ)的納米載體傳遞miR-1抑制劑來早期靶向治療小鼠心肌梗死，在小鼠心肌梗死發(fā)生后黃金救治時間內(nèi)對梗死部位進行治療，研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體的亞型（AT1）在心肌梗死后24 h 內(nèi)表達最明顯，并且開發(fā)了一種以AT1 靶向肽為靶點的納米載體（AT1-PEG-DGL），將其與AMO-1 相結(jié)合；靜脈給藥后的成像表明AT1-PEG-DGL 早期迅速積累在心肌梗死心臟中，顯著優(yōu)于沒有AT1 靶向的對照組；最重要的是，在單次靜脈注射后發(fā)現(xiàn)效果顯著的抗心肌細胞凋亡作用，心肌梗死邊緣區(qū)的凋亡細胞顯著減少，梗死面積比對照組減少64.1%，提示有希望用于早期心肌梗死治療。

先前有研究顯示可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑（sEHIs）能夠產(chǎn)生對缺血誘導(dǎo)的致死性心律失常的心臟保護作用[32-33]。Gui 等[34]通過結(jié)扎冠狀動脈建立小鼠心肌梗死模型，觀察到新型sEHIs t-AUCB通過抑制miR-1 的過表達，促使KCNJ2/ Kir 2.1 和GJA1/Cx43 mRNA/蛋白質(zhì)的上調(diào)，進一步研究結(jié)果表明PI3K/Akt 信號通路可能參與了sEHIs 對miR-1的負調(diào)控，從而降低心肌梗死小鼠的梗死面積和誘導(dǎo)性心律失常的發(fā)生率。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)也有相關(guān)研究，Wu 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)心顆粒通過調(diào)節(jié)miR-1 和PKC 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)來保護縫隙連接及其組成部分Cx43 的超微結(jié)構(gòu)，并且在大鼠心肌梗死模型中顯著增加心室顫動閾值，從而降低梗死后缺血性致死性心律失常的發(fā)生率。

3 展望

目前，miRs 用于心肌梗死早期診斷的研究結(jié)果不一，由于不同miRs 診斷價值不同，需要2 或3 種miRs 的組合才能優(yōu)于目前的金標(biāo)準(zhǔn)cTn，致使成本相應(yīng)增加，臨床應(yīng)用仍然需要大規(guī)模、多中心的研究來進一步明確最有診斷價值的miR，同時加快對其穩(wěn)定性、跨膜性、特異性、安全性、成藥性以及如何才能建立滿足臨床需要的檢測方法等研究，并且可以進一步細化其診斷特異性，才能使其盡早安全有效地應(yīng)用于臨床，例如Li 等[36]進一步研究具備診斷冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂的標(biāo)志物miRs，具有較好前景，可填補目前這方面生物學(xué)標(biāo)志物的空白。從治療方面看，目前大多數(shù)研究基于基礎(chǔ)研究，臨床的心肌梗死模型多為永久性損傷模型，沒有考慮到再灌注治療對其效果影響，這需要逐步結(jié)合臨床，采用能反映臨床實際的缺血再灌注模型來研究，同時找出更合適的miRs 載體，尋求更可靠的靶向治療策略，以及給藥方式和給藥時機的把握，這些都需要進一步研究。