高通量測序分析不同增菌溫度下冷鮮雞肉細菌的群落多樣性

溫冬玲，成淑君，劉 悅，余 倩,*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.深圳市沙井職業(yè)高級中學，廣東 深圳 518100）

冷鮮雞是指對屠宰后的雞肉胴體嚴格執(zhí)行獸醫(yī)檢驗檢疫制度和無公害管理，迅速對胴體進行冷卻處理，使胴體溫度在24 h內(nèi)降低至0～4 ℃，并在后續(xù)加工、流通及銷售過程中保持在這個溫度范圍內(nèi)[1]。作為我國雞肉未來消費的主要模式，冷鮮雞肉在其貯藏、運輸、零售等過程中雖大部分微生物的生長受到抑制，但嗜冷菌仍然能正常生長繁殖直至冷鮮雞肉發(fā)生腐敗。當冷鮮雞肉在貯藏過程中溫度控制不當時，極易引起低溫下生長緩慢或不生長的嗜溫菌迅速繁殖，造成冷鮮雞肉品質(zhì)下降，貨架期縮短。因此，嗜冷菌和嗜溫菌是影響冷鮮雞肉腐敗變質(zhì)的主要菌群，尤其是嗜冷菌，是低溫貯藏食品衛(wèi)生檢測的“指示菌”。

最初對冷鮮肉微生物多樣性的研究方法多數(shù)停留在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和傳統(tǒng)分子生物學方法上，且大部分集中在冷鮮牛肉、羊肉、豬肉及各種水產(chǎn)類研究上（魚、蝦、貝等）[2-5]。然而，近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)在微生物群落研究方面表現(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢，目前已廣泛應用于醫(yī)學[6]、環(huán)境水土污染[7-8]、人體胃腸道[9]等多個方面。雖然在食品領(lǐng)域的應用尚處于初期階段，但在近幾年來發(fā)展迅速，尤其對肉制品[10-11]、水產(chǎn)品[12-13]、發(fā)酵類食品[14-15]中的細菌群落多樣性有著越來越多的研究。

目前對冷鮮雞肉貯藏過程中細菌群落多樣性研究報道不多，研究方法包括有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、16S rDNA測序、高通量測序等，其中劉朏[16]、肖英平等[17]從不同貯藏溫度、不同采樣方法方面對冷鮮雞肉貯藏微生物進行檢測分析。然而，采用高通量測序技術(shù)對不同增菌溫度下的冷鮮雞肉細菌群落多樣性的研究鮮見報道。冷鮮雞肉樣品在進行高通量測序前，首先需采集樣品的細菌并提取DNA。為提取較高質(zhì)量的DNA，提高細菌的檢出率，需對不同貯藏時間的冷鮮雞肉的細菌進行增菌處理，取其增菌液進行細菌總DNA提取。目前現(xiàn)行的標準GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中規(guī)定培養(yǎng)溫度為（36±1）℃，該條件下培養(yǎng)所得結(jié)果只包括嗜中溫性需氧微生物菌落總數(shù)。目前采取的細菌增菌溫度多為37 ℃，而對于以嗜冷菌和嗜溫菌為主導的低溫貯藏冷鮮雞肉來說，培養(yǎng)溫度為（36±1）℃多為嗜溫菌生長繁殖，而嗜冷菌生長在一定程度上被抑制，其所得微生物檢測結(jié)果并不能完全客觀地反映出冷鮮雞肉的衛(wèi)生質(zhì)量[18]。倘若能對冷鮮雞肉嗜冷菌和嗜溫菌進行全面檢測，并結(jié)合兩者測定結(jié)果作綜合評價，這樣可以對冷鮮雞肉的衛(wèi)生質(zhì)量有個更為完善的認識。因此，本實驗選取4 ℃和37 ℃兩種增菌溫度，研究比較不同貯藏時間的冷鮮雞肉群落多樣性差異及菌群演替變化規(guī)律，以期為冷鮮雞肉低溫貯藏過程或貯藏溫度失控情況下有效實施冷鮮雞肉質(zhì)量安全控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮雞肉購買于廣州海珠區(qū)萬國廣場家樂福超市，置冰盒里0.5 h內(nèi)送回實驗室，在無菌環(huán)境下將雞肉隨機分為7 組，每組2等份，每份25 g，經(jīng)保鮮袋密封包裝后放置于4 ℃冰箱貯藏。以購買當天為0 d，作為對照組，其余6 組為實驗組，分別貯藏2、4、6、8、10、12 d。依據(jù)冷鮮雞肉的新鮮度分為貯藏前期（0～4 d）、中期（6～8 d）、后期（10～12 d）3 個階段。

KAPA HiFi Polymerase、Solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 儀器與設備

5418微型離心機 德國Eppendorf公司；My Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；2100生物分析儀、個人化操作基因組測序（personal genome machine，PGM）系統(tǒng) 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌總DNA的提取

無菌環(huán)境下，分別取不同貯藏時間的2 份冷鮮雞肉樣品25 g剪碎后放入裝有225 mL 0.9%無菌生理鹽水的三角瓶，充分振蕩后，取1 mL菌液加入40 mL的LB肉湯中分別置于4 ℃增菌7 d和37 ℃增菌24 h。取增菌液1 mL至EP管內(nèi)，采用Solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒按照相應操作步驟進行。

1.3.2 16S rDNA V3區(qū)高通量測序

高通量測序文庫的構(gòu)建和Ion Torrent PGM高通量測序工作由上海伯豪生物科技有限公司完成。細菌V3可變區(qū)采用的測序引物為338F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’），533R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。對細菌16S rDNA基因V3可變區(qū)進行PCR擴增。擴增反應體系（25 μL）：2×KAPA HiFi Mix 12.5 μL、引物（10 μmol/L）1 μL、DNA模板（30 ng）1 μL、ddH2O 10.5 μL。參數(shù)：98 ℃預變性45 s；98 ℃變性15 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)20 次；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃條件下保溫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗使用QIIME（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）軟件對測序原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除低質(zhì)量的序列，最后獲得的高質(zhì)量有效序列用于進一步的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）分析[19]。按97%相似性標準進行OTU聚類，然后利用RDP-classifier（https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）及Silva數(shù)據(jù)庫（Release119: http://www.arb-silva.de）進行物種注釋和分類學分析?；贠TU的分析結(jié)果，采用對樣本序列進行隨機抽樣的方法，計算常用的Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao I指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage值，并作出相應的稀釋曲線。Chao I指數(shù)和ACE指數(shù)用于評價菌群豐富度，其數(shù)值越高表明群落物種豐富度越高；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映物種多樣性，Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正相關(guān)，Simpson指數(shù)則相反，Simpson指數(shù)越大，群落多樣性越低。Coverage值是用于計算當前測序深度指標，該指數(shù)代表每個樣品文庫的覆蓋率，Coverage值越高，表明該樣本中序列沒有被測出的概率較低，樣本文庫覆蓋率越高。通過多變量統(tǒng)計學方法的主成分分析（principal component analysis，PCA），可以直觀顯示不同樣品群落之間物種組成的相似性及差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與OTU分析

由于在高通量測序過程會引入錯誤或者不可靠堿基等測序錯誤，對下游生物信息分析造成很大影響，因此需要對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行優(yōu)化處理。通過利用QIIME軟件對測序得到的下機序列數(shù)，即原始序列數(shù)，進行過濾，去除低質(zhì)量序列片段、錯誤序列、連接后引物序列以及無法與數(shù)據(jù)庫中序列信息比對一致的序列后得到最終的有效序列。由表1可知，14 個樣品經(jīng)過測序后得到的下機序列總數(shù)為261 968 個，其中有效序列總數(shù)達154 610 個，且每個樣品的有效序列數(shù)均達到10 000以上，有效序列百分比都達50%以上。這說明本次測序所得到的有效序列可以達到后續(xù)微生物多樣性分析的要求。樣品同一貯藏時間的冷鮮雞肉在4 ℃得到的OTU數(shù)目普遍比37 ℃多，說明在4 ℃冷鮮雞肉中的微生物多樣性比37 ℃下更豐富。同一增菌溫度下比較，不同的貯藏時間得到的OTU數(shù)目不同，其中在貯藏后期（10～12 d）得到的OTU數(shù)目較大，可能是由于在貯藏后期冷鮮雞肉發(fā)生了腐敗變質(zhì)，而引起腐敗變質(zhì)的微生物種類較多。

稀釋性曲線是通過對序列進行隨機抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建的曲線。它可用于說明測序數(shù)據(jù)的合理性、測序量能否涉及所有菌群。利用R語言工具作曲線圖，如圖1所示。隨著測序量的不斷增加，每個樣品稀釋性曲線有趨向平緩的趨勢，說明實驗的測序量基本反映出樣品中絕大部分的物種信息。

表1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Statistic results of sequence data

圖1 14 個樣品稀釋性曲線Fig. 1 Rarefaction curves for 14 samples

2.2 不同增菌溫度下冷鮮雞肉細菌群落的Alpha多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標的ACE、Chao I、Shannon及Simpson指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。由表2可以看出，Chao I、ACE、Shannon指數(shù)在4 ℃數(shù)值普遍高于37 ℃的，Simpson指數(shù)剛好相反，表明在4 ℃獲得的微生物群落多樣性與豐富度比37 ℃高。其中Chao I、ACE指數(shù)值最大為樣品4d2，其次為樣品4d12，數(shù)值最小為樣品37d0，說明4 ℃貯藏第2天的冷鮮雞肉物種豐富度達到最高，可能是由于此時冷鮮雞肉中營養(yǎng)成分含量較高，細菌迅速生長繁殖，甚至達到細菌的對數(shù)生長期；而貯藏第12天物種豐富度也比較高，可能是由于冷鮮雞肉此時已淪為腐敗，腐敗菌含量迅速增加，占主要優(yōu)勢。對于Shannon指數(shù)，最大為樣品4d10，其次為4d6與4d12，最小為37d0，而Simpson指數(shù)變化則相反。這說明了4 ℃冷鮮雞肉貯藏10 d微生物多樣性最高，37 ℃冷鮮雞肉貯藏第0天微生物多樣性最低。

此外，表中的Coverage值都大于97%，說明樣品文庫的覆蓋率高，樣品中序列沒有被測出的概率較低，反映了本次測序結(jié)果可以代表樣本的真實情況。

表2 Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes

2.3 不同增菌溫度下細菌群落結(jié)構(gòu)分析

采用RDP-classifier對各樣品中OTU進行物種注釋可以鑒定到冷鮮雞肉在貯藏過程中細菌分屬于5 門、12 綱、20 目、39 科、53 屬。本實驗就門、屬分類學水平做具體分析。

2.3.1 基于門分類水平上進行分析

圖2 基于門分類水平上的樣品菌群分布圖Fig. 2 Bacterial community distribution at the phylum level

由圖2可知，不同貯藏時間的冷鮮雞肉微生物菌群在4 ℃和37 ℃得到的菌相主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）3 大菌門組成。根據(jù)各樣品在門水平菌群比例分布圖可以看出，不同貯藏時間的冷鮮雞肉在不同增菌溫度下微生物菌群組成存在較大的差異，但也存在一定的共性，其中Proteobacteria和Firmicutes廣泛存在于14 個單樣品中，并且占據(jù)優(yōu)勢。Proteobacteria相對豐度在48.97%～97.17%范圍內(nèi)，且不同貯藏時間及增菌溫度下所占比例也不盡相同，其中在4 ℃貯藏第0、4天和37 ℃貯藏第12天所占比例較大，分別為88.71%、97.17%和88.43%。其次是Firmicutes，它在冷鮮雞肉貯藏前期（0～4 d）總體含量較貯藏中期（6～8 d）、后期（10～12 d）高；到貯藏中期時，Bacteroidetes迅速增加，所占比例遠大于Firmicutes，最高達到48.97%，成為第2大優(yōu)勢菌門，說明隨著貯藏時間延長，Bacteroidetes對冷鮮雞肉的腐敗變質(zhì)起了越來越大影響，與目前已有的相關(guān)研究結(jié)果一致[20]。除這些主要菌門外，還存在一些豐度較低的放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、其他未知分類（unclassified）以及未知細菌菌門（bacteria_unclassified），有些相對豐度不足0.01%，圖2中顯示不明顯。這也說明了冷鮮雞肉在貯藏過程中微生物多樣性豐富，豐度比較集中的特點。

2.3.2 基于屬分類水平上進行分析

不同貯藏時間的冷鮮雞肉在4 ℃和37 ℃條件下共分離得到53 個不同的屬。圖3為屬分類水平上相對豐度大于1%的菌群柱狀分布圖。在門水平上占主要優(yōu)勢的Proteobacteria在屬的分類水平上主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanellaceae）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、變形桿菌屬（Proteus）、摩根氏菌屬（Morganella）、污蠅桿菌屬（Wohlfahrtiimonas）等。Firmicutes在屬水平上主要包括有腸球菌屬（Enterococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、漫游球菌屬（Vagococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、魯梅利桿菌屬（Rummeliibacillus）等；Bacteroidetes在屬水平上鑒定到的菌屬主要有類香味菌屬（Myroides）、擬桿菌屬（Bacteroides）等。

由圖3可知，在4 ℃和37 ℃微生物菌群種類和豐度大小存在較大的差異性。在4 ℃冷鮮雞肉主要以Pseudomonas、Shewanellaceae、Acinetobacter、Myroides及其他未知菌菌屬為主；其中Pseudomonas占最大的比例，最高達44.03%，為冷鮮雞肉貯藏過程中的主要優(yōu)勢菌群，與目前大多數(shù)冷鮮肉優(yōu)勢腐敗菌研究結(jié)果一致[21-23]。其次為Shewanellaceae、Acinetobacter，最高分別占菌群的38.23%、24.64%。研究報道，Pseudomonas和Pseudomonas低溫環(huán)境生長能力很強，且具有很強的產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物的能力，是低溫貯藏冷鮮肉的優(yōu)勢腐敗菌[17,24]。然而，這些菌在37 ℃未檢出或檢出量很少。Weissella在4 ℃貯藏前2d含量較大，可達26.7%，而在貯藏中期和后期豐度很低，小于0.1%。

在37 ℃條件下，Myroides、Wohlfahrtiimonas、Citrobacter、Lactococcus、Proteus和其他未知菌屬（bacteria_p_other）所占的比例相對較大，其中bacteria_p_other占最大比例，但未能鑒定到具體菌屬，有待進一步研究。Wohlfahrtiimonas在37 ℃檢出，而4 ℃未發(fā)現(xiàn)或豐度很低，而且Wohlfahrtiimonas在貯藏后期所占比例逐漸增大，在第12天達到最大值30.19%，加速了冷鮮雞肉的腐敗變質(zhì)。據(jù)報道，污蠅桿菌是近年來新發(fā)現(xiàn)的條件致病菌[25]，在國內(nèi)的肉類研究中鮮見報道，而2016年在國外巴西里約熱內(nèi)盧曾報道了從零售冷凍雞中分離新型人畜共患病原體污蠅解殼桿菌，可見該菌在低溫下也能生長[26]。因此，對于污染了Wohlfahrtiimonas的肉類應引起高度重視。Lactococcus在冷鮮雞肉貯藏的整個過程中均存在，豐度雖不高，維持在0.84%～20.95%之間，但對冷鮮雞肉腐敗也存在較大的影響。

在4 ℃和37 ℃條件下，Myroides在貯藏前期均未檢出或檢出量很少，直到第6天，冷鮮雞肉開始發(fā)生腐敗變質(zhì)后，其所占的比例總體上呈增加趨勢，最高達41.17%，說明該菌是影響冷鮮雞肉腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢菌群。

Myroides原屬芳香黃桿菌屬，共有5個種，香味類香味菌為該屬模式種，是一種條件致病菌，在自然界中廣泛分布，且具有較強的耐藥性[27]。近年來對該菌屬在鮮肉上的污染報道逐漸增多[28-31]，也有文獻報道Myroides作為一種優(yōu)勢腐敗菌出現(xiàn)在冷鮮肉中。其中施荷等[28]在研究冷鮮鹿肉貯藏期間菌相變化中發(fā)現(xiàn)，在貯藏末期棕色類香味菌（Myroides phaeus）是造成冷鮮鹿肉腐敗的優(yōu)勢腐敗菌之一。Yang Chao等[30]在研究冷鮮豬肉貯藏過程優(yōu)勢腐敗菌中也檢測出Myroides，且貯藏后期所占比例高于Pseudomonas，與本實驗研究結(jié)果一致，可能是由于Myroides能產(chǎn)生一種碳青霉烯抗菌劑，一定程度上抑制了其他細菌的生長。

圖3 基于屬分類水平上的樣品菌群分布Fig. 3 Bacterial community distribution at the genus level

綜合以上分析也發(fā)現(xiàn)低溫貯藏冷鮮雞肉的主要菌群以嗜冷菌和嗜溫菌為主。當冷鮮雞肉在貯藏過程中溫度失控時，嗜溫菌或部分污染的致病菌會大量繁殖，加促冷鮮雞肉腐敗。結(jié)合37 ℃和4 ℃兩種增菌溫度分析，可以較完全地反映冷鮮雞肉在貯藏過程中污染的細菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律。

2.4 冷鮮雞肉貯藏中不同增菌溫度下細菌群落的PCA

依照不同貯藏時間將冷鮮雞肉樣品分為7 個組，每組由同一貯藏時間的4 ℃和37 ℃兩種增菌溫度的樣品組成。樣品之間距離越近，表示樣品群落結(jié)構(gòu)組成越相似。如圖4所示，PC1與PC2的貢獻率分別為40.83%和21.55%，說明這兩個主成分是解釋樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異的主要因素。不同貯藏時間及不同增菌溫度下的各個樣品能明顯地分離，表明各個樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)組成具有一定的差異，其中在PC1方向上，4 ℃和37 ℃的樣品能夠顯著地分布在兩個區(qū)域，說明細菌增菌溫度在PC1水平上對樣品菌群結(jié)構(gòu)變化影響顯著；而在PC2上，不同貯藏時間的樣品區(qū)分明顯，這說明不同貯藏時間在PC2水平上對樣品菌群結(jié)構(gòu)變化影響顯著。同一增菌溫度下貯藏前期（0～4 d）的樣品與貯藏中期（6～8 d）、貯藏后期（10～12 d）樣品之間分布距離較大，主要是由于冷鮮雞肉在貯藏前期仍處于鮮肉與次鮮肉狀態(tài)，而在貯藏中期開始發(fā)生腐敗，直到貯藏后期完全腐敗，進而導致冷鮮雞肉群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了較大變化。然而，除了樣品4d10與4d12，其他處于貯藏前期、中期、后期的各個樣品間距離較小，說明同一時期的樣品群落結(jié)構(gòu)組成較相似。

圖4 樣品PCAFig. 4 PCA of bacterial communities

3 結(jié) 論

本實驗對不同貯藏時間的冷鮮雞肉細菌在4 ℃和37 ℃條件下的增菌液進行細菌基因組DNA提取，并通過基于16S rDNA基因的高通量測序技術(shù)分析。結(jié)果表明：4 ℃與37 ℃條件下微生物群落多樣性與演替規(guī)律存在較大差異。共鑒定到細菌5門、12綱、20目、39科、53屬。在門水平上，均以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。在屬水平上，4 ℃增菌溫度下，貯藏前期（0～4 d）冷鮮雞肉以Pseudomonas、Shewanellaceae、Acinetobacter為主要的優(yōu)勢菌，其中Pseudomonas占最大的比例，最高達44.03%，為冷鮮雞肉貯藏前期優(yōu)勢菌；在貯藏中后期，Myroides迅速增加，在12 d達到最大，大于Pseudomonas，成為影響冷鮮雞肉貯藏中后期腐敗變質(zhì)的主要菌屬。而在37 ℃條件下，Citrobacter、Proteus、Lactococcus、Bacteroides在貯藏前期含量相對較大，到貯藏中后期，主要以Myroides、Wohlfahrtiimonas為主，而Wohlfahrtiimonas在貯藏前期未檢出或含量很低，在貯藏后期所占比例逐漸增大，在12 d達到最大值30.19%，加促了冷鮮雞肉的腐敗。