基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR技術(shù)的麥芽品種純度定性和定量檢測(cè)

蔣培基，王德良，徐東東，黃承雪，郭剛剛，欒春光,*，蒲 彪*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

大麥屬于小麥族大麥屬，是古老的禾谷物作物之一，是我國(guó)繼水稻、小麥、玉米之后的第4大禾本科作物[1]。麥芽是由大麥浸泡吸水發(fā)芽后烘干而成，是啤酒釀造的主要原料[2]。大麥麥芽一直以來(lái)都是啤酒廠(chǎng)把控產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵[3]。麥芽質(zhì)量的好壞不僅影響啤酒品質(zhì)以及口感，而且不同麥芽品種之間的淀粉、蛋白質(zhì)等成分存在的差異也會(huì)造成啤酒廠(chǎng)在釀造工藝上存在一定的差別[4]。目前，大麥種植過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)由于機(jī)械、生物等途徑造成的混雜，制麥和銷(xiāo)售中也會(huì)出現(xiàn)不法商販的人為摻假，導(dǎo)致市面上的大麥麥芽均一性不高，因此給釀造工藝的選擇上帶來(lái)很多問(wèn)題，啤酒質(zhì)量得不到保障[5-8]。所以，對(duì)于啤酒行業(yè)開(kāi)展大麥麥芽的品種和純度檢測(cè)勢(shì)在必行。

近些年來(lái)，快速發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)以其遺傳穩(wěn)定、重復(fù)性好及易操作等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)開(kāi)始替代同工酶電泳和簡(jiǎn)單理化指標(biāo)分析等傳統(tǒng)方法，成為農(nóng)作物品種鑒定的主要方法[9]。基于第1、2代DNA分子標(biāo)記技術(shù)建立起來(lái)的農(nóng)作物品種鑒定方法，比如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[10-14]、隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性[15-16]和簡(jiǎn)單重復(fù)序列[17-18]，相對(duì)于蛋白水平的鑒定具有一定優(yōu)勢(shì)，但這些方法都是基于核酸片段的多少和片段大小完成物種的鑒別。對(duì)于親緣關(guān)系相近的品種之間存在判斷上的誤差，且無(wú)法完成混雜或人為摻雜的樣品進(jìn)行檢測(cè)[19]。為克服以上缺點(diǎn)，人們開(kāi)發(fā)出了第3代DNA分子標(biāo)記，即單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）。該分子標(biāo)記的出現(xiàn)為農(nóng)作物的品種鑒定提供了更為高效、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)手段。楊潤(rùn)婷等[20]對(duì)比了兩種常用的SNP分型方法，等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（allele-specific polymerase chain reaction，ASPCR）和高分辨率熔解曲線(xiàn)分析（high resolution melting analysis，HRMA），對(duì)16 個(gè)柚栽培品種和8 個(gè)柚雜種后代材料進(jìn)行7 個(gè)SNP位點(diǎn)的分型研究時(shí)發(fā)現(xiàn)AS-PCR和HRMA均適用于柚類(lèi)品種的區(qū)分和鑒定。 而AS-PCR方法是一種準(zhǔn)確、低成本的SNP分型方法，適合普通實(shí)驗(yàn)室使用。Bungartz等[21]用SNP基因芯片對(duì)20 個(gè)大麥品種進(jìn)行品種鑒定研究，共發(fā)現(xiàn)6 334 個(gè)SNP標(biāo)記。高麗峰等[22]分析來(lái)自Illumina小麥9K Infmium SNP芯片數(shù)據(jù)中6 254 個(gè)位點(diǎn)，從中篩選出43 個(gè)足以將193 份名優(yōu)特和359 份實(shí)驗(yàn)材料分開(kāi)的SNP位點(diǎn)。除在基因組水平分析尋找相應(yīng)的SNP標(biāo)記物外，Pattemore等[23]還通過(guò)兩個(gè)大麥品種的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行序列分析并確定了兩個(gè)典型大麥品種SNP的數(shù)量和分布，生成一組能區(qū)分兩個(gè)品種的特異性SNPs。以上研究表明，大麥基因組中含有豐富的多態(tài)性良好的SNP位點(diǎn)，可以用來(lái)對(duì)品種進(jìn)行快速有效的鑒定。但以上研究中并未提出基于SNP檢測(cè)技術(shù)鑒定大麥麥芽品種的具體方法，而利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)大麥麥芽純度的檢測(cè)也鮮有研究報(bào)道，張利莎等[24]利用30 個(gè)SNP位點(diǎn)成功對(duì)大麥麥芽盲樣進(jìn)行檢測(cè)，但是實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有提供大麥品種在各個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型，無(wú)法直接用于實(shí)際檢測(cè)。

目前，SNP檢測(cè)方法雖然有所發(fā)展，但通過(guò)直接測(cè)序法確認(rèn)的SNP結(jié)果往往受測(cè)序深度的影響，無(wú)法從測(cè)序誤差中鑒別出雜合子，所以需要更多的重復(fù)實(shí)驗(yàn)提高準(zhǔn)確性[25]。隨著測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展，測(cè)序成本越來(lái)越低，直接測(cè)序法得到越來(lái)越多人的青睞[26-27]。Taq man探針與競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術(shù)的出現(xiàn)，不僅使得SNP的檢測(cè)更為高效、準(zhǔn)確，而且操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高[28-30]。從而也使得基于SNP對(duì)品種鑒定的方法得以應(yīng)用與推廣。本研究擬通過(guò)測(cè)序的方法，篩選并確認(rèn)出能夠區(qū)分7 個(gè)大麥麥芽品種的SNP位點(diǎn)，進(jìn)而運(yùn)用KASP技術(shù)對(duì)麥芽樣品進(jìn)行定性定量的檢測(cè)，從而建立了可以用來(lái)對(duì)麥芽進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花30、風(fēng)啤麥4號(hào)、風(fēng)啤麥3號(hào)、Sebastian、麥特卡夫、卡普蘭德、海德曼斯，由中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院收集。預(yù)混樣品由麥特卡夫與卡普蘭德混合，混合比例為1∶1，并標(biāo)注為“麥特卡夫”，由中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院提供。

Taq酶、dNTP、10×Loading buffer 大連寶生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；KASP引物 上海艾吉析科技有限公司；植物基因組DNA高效提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96 Well Thermal Cycler、Qubit3.0熒光定量PCR儀北京Thermo Fisher Scientific有限公司；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 大麥麥芽基因組的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg液氮研磨的麥芽粉末放入2 mL EP（Eppendorf）管中，按天根高效植物DNA提取試劑盒步驟提取大麥麥芽基因組DNA。提取的基因組DNA采用0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。經(jīng)0.8%凝膠電泳檢測(cè)后，條帶完整，沒(méi)有降解。且條帶大小處于所需目的片段范圍之內(nèi)。經(jīng)Qubit3.0熒光定量PCR儀檢測(cè)后，DNA質(zhì)量濃度均大于120 ng/μL，完全符合實(shí)驗(yàn)所需的DNA質(zhì)量濃度要求。

1.3.2 SNP位點(diǎn)的篩選

從NCBI上下載大麥基因組序列，通過(guò)Visual Genomics軟件篩選所需的SNP位點(diǎn)，參數(shù)選擇默認(rèn)值。然后，在篩選到的多態(tài)性較好的108 個(gè)位點(diǎn)上下游300～500 bp位置設(shè)計(jì)引物，作為擴(kuò)增的目的片段，擴(kuò)增片段的引物采用premier 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)。然后，以7 種大麥麥芽的基因組DNA為模板，用PCR儀擴(kuò)增目的片段，PCR體系為20 μL：10×loading buffer 2 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；基因組DNA 1 μL（120 ng）；Taq酶0.2 μL；ddH2O 13.8 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增之后的產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司北京測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用MegAlign軟件進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)篩選出的SNP位點(diǎn)，并建立對(duì)應(yīng)7 個(gè)品種的SNP位點(diǎn)序列表與品種區(qū)分路線(xiàn)圖。

1.3.3 KASP引物的驗(yàn)證

根據(jù)SNP位點(diǎn)前后的序列信息設(shè)計(jì)合成KASP引物（表1）。以7 種大麥麥芽品種基因組DNA為模板，利用ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行KASP檢測(cè)。KASP體系：DNA（50 ng/μL）1 μL ，2×master mix 5 μL，雙蒸水4 μL，primer mix 0.14 μL。KASP條件：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃退火、延伸60 s，10 個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)降低0.6 ℃）；94 ℃變性20 s，55 ℃退火、延伸60 s，26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)條件的設(shè)置以及結(jié)果的讀取均在7500 Software v2.3軟件上進(jìn)行，對(duì)比確認(rèn)基因型檢測(cè)的結(jié)果是否與一代測(cè)序統(tǒng)計(jì)結(jié)果SNP序列表中數(shù)據(jù)一致，驗(yàn)證KASP引物的準(zhǔn)確性。

表1 KASP引物信息Table 1 Information about KASP primers

1.3.4 預(yù)混麥芽樣品的定性檢測(cè)

從預(yù)混樣“麥特卡夫”中稱(chēng)取100 mg大麥麥芽樣品，在研缽中加液氮研磨，稱(chēng)取50 mg放入EP管中。按照1.3.1節(jié)的方法提取DNA以及對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次，提取3 份樣品DNA，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。以檢測(cè)合格的DNA樣品為模板，選擇驗(yàn)證過(guò)的具有較好多態(tài)性的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的KASP引物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。此外，每個(gè)位點(diǎn)加入對(duì)應(yīng)兩種不同基因型的大麥麥芽DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣品如表2所示。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件見(jiàn)1.3.3節(jié)，反應(yīng)條件的設(shè)置以及結(jié)果的讀取均在7500 Software v2.3軟件上進(jìn)行。該KASP實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于對(duì)比各SNP位點(diǎn)實(shí)測(cè)基因型是否與表2中麥特卡夫的基因型的一致性。

表2 定性檢測(cè)所使用陽(yáng)性對(duì)照Table 2 Positive controls used for qualitative detection in this study

1.3.5 預(yù)混麥芽樣品定量檢測(cè)

根據(jù)1.3.4節(jié)的檢測(cè)結(jié)果，選取雜合基因型的SNP作為定量檢測(cè)的位點(diǎn)。從“麥特卡夫”樣品中隨機(jī)挑取100 粒大麥麥芽，每粒麥芽按照1.3.1節(jié)的方法提取基因組DNA作為定量檢測(cè)的DNA模板，用雜合基因位點(diǎn)的KASP引物在ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀器上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件如1.3.3節(jié)所示，反應(yīng)條件的設(shè)置以及結(jié)果的讀取均在ABI7500 Software v2.3軟件上進(jìn)行。定量檢測(cè)的結(jié)果以雜合位點(diǎn)上出現(xiàn)的麥特卡夫個(gè)數(shù)占總反應(yīng)數(shù)的比值計(jì)算“麥特卡夫”樣品的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點(diǎn)的篩選

表3 普通PCR引物信息Table 3 Information about the common PCR primers

表4 SNP標(biāo)記信息Table 4 Information about SNP markers

表5 大麥麥芽品種的SNP信息Table 5 SNP data for 7 barley cultivars

圖1 7 個(gè)品種基于SNP區(qū)分路線(xiàn)圖Fig. 1 SNP-based discrimination of 7 varieties

本研究成功篩選4 個(gè)多態(tài)性良好的SNP位點(diǎn)。用于擴(kuò)增4 個(gè)SNP位點(diǎn)的普通PCR引物信息如表3所示，對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)信息如表4所示。同時(shí)，并根據(jù)不同麥芽品種在各位點(diǎn)的堿基差異建立7個(gè)麥芽品種的SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)表（表5）及樣品純度鑒定的圖譜（圖1）。

2.2 KASP引物的驗(yàn)證

以7 個(gè)大麥麥芽品種的基因組DNA為模板，利用每個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的KASP引物在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行基因分型的檢測(cè)，以此確認(rèn)位點(diǎn)以及KASP引物的準(zhǔn)確性。SNP基因型檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。B01位點(diǎn)的引物驗(yàn)證結(jié)果（圖2a）表明：風(fēng)啤麥4號(hào)、風(fēng)啤麥3號(hào)、海德曼斯的檢測(cè)的位點(diǎn)結(jié)果為GG；花30、Sebastian、麥特卡夫、卡普蘭德的檢測(cè)的位點(diǎn)結(jié)果為AA。B02位點(diǎn)引物驗(yàn)證結(jié)果（圖2b）表明：花30檢測(cè)結(jié)果為GG；風(fēng)啤麥4號(hào)、風(fēng)啤麥3號(hào)、Sebastian、麥特卡夫、卡普蘭德以及海德曼斯的檢測(cè)結(jié)果為CC。B03的引物驗(yàn)證結(jié)果（圖2c）表明：花30、麥特卡夫、海德曼斯檢測(cè)結(jié)果為CC；風(fēng)啤麥4號(hào)、風(fēng)啤麥3號(hào)、Sebastian、卡普蘭德檢測(cè)結(jié)果為GG。B04號(hào)位點(diǎn)的引物驗(yàn)證結(jié)果（圖2d）表明：風(fēng)啤麥4號(hào)、Sebastian檢測(cè)結(jié)果為CC；花30、風(fēng)啤麥3號(hào)、麥特卡夫、卡普蘭德、海德曼斯檢測(cè)結(jié)果為T(mén)T。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 個(gè)位點(diǎn)的KASP引物對(duì)7 個(gè)品種進(jìn)行SNP檢測(cè)結(jié)果與一代測(cè)序結(jié)果一致，表明SNP位點(diǎn)和KASP引物的正確性，位點(diǎn)和引物可用于后續(xù)的檢測(cè)。

圖2 B01（a）、B02（b）、B03（c）、B04（d）位點(diǎn)KASP引物驗(yàn)證結(jié)果圖Fig. 2 Results of KASP primer validation at B01 (a), B02 (b), B03 (c), and B04 (d)

2.3 預(yù)混麥芽樣品的定性檢測(cè)結(jié)果

圖3 B01（a）、B02（b）、B03（c）位點(diǎn)樣品基因型檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Qualitative detection of B01 (a), B02 (b), and B03 (c)SNP markers

圖3 a表明，3份“麥特卡夫”樣品DNA的檢測(cè)結(jié)果為AA。圖3b表明，陽(yáng)性對(duì)照麥特卡夫與3份“麥特卡夫”樣品DNA檢測(cè)結(jié)果相同，為CC。圖3c表明，3份“麥特卡夫”樣品檢測(cè)結(jié)果為GC。統(tǒng)計(jì)3 個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與麥特卡夫標(biāo)準(zhǔn)品在這3 個(gè)SNP位點(diǎn)基因型做比較，見(jiàn)表6。B01、B02位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果與麥特卡夫一致，B03位點(diǎn)出現(xiàn)了雜合，說(shuō)明該SNP標(biāo)記在“麥特卡夫”混合樣中具有多態(tài)性，能夠用于后續(xù)麥芽混合樣的定量檢測(cè)。

表6 麥特卡夫樣品與麥特卡夫標(biāo)準(zhǔn)品在SNP位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果比較Table 6 Comparison of the results for Metcalf and Metcalf standards with three SNP markers

2.4 預(yù)混麥芽樣品的定量檢測(cè)結(jié)果

由定性檢測(cè)結(jié)果可知B03位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)，可用于定量檢測(cè)。在檢測(cè)的100 粒大麥麥芽DNA樣品中，48.6%的樣品基因型在B03位點(diǎn)上是G（舍去少量未成功檢測(cè)的DNA樣品），即 “麥特卡夫”麥芽樣品純度為48.6%（圖4），與預(yù)混樣真實(shí)值50%之間的誤差小于3%。

圖4 B03位點(diǎn)“麥特卡夫”定量檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Quantitative detection of Metcalfe using B03 SNP marker

3 結(jié) 論

本研究利用生物信息學(xué)方法，篩選并鑒定出4 個(gè)能夠區(qū)分7 個(gè)大麥麥芽品種的SNP位點(diǎn)。同時(shí)，合成了KASP引物，并驗(yàn)證了KASP引物的正確性。結(jié)合KASP基因分型技術(shù)，對(duì)預(yù)混麥芽樣品“麥特卡夫”樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明該樣品為混合樣品，“麥特卡夫”的純度為48.6%。檢測(cè)的效率與準(zhǔn)確度能夠滿(mǎn)足啤酒企業(yè)的需求，該方法為后續(xù)大麥麥芽品種的SNP分子標(biāo)記鑒定方法的建立提供了新的實(shí)驗(yàn)思路以及數(shù)據(jù)庫(kù)信息，為啤酒企業(yè)對(duì)原料質(zhì)量的控制提供了可實(shí)際應(yīng)用的方法。