動物源性食品中青霉素類藥物殘留檢測

馬燕紅，王 妍，李志剛，李瑩瑩，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

近幾十年來抗生素，尤其是β-內酰胺類抗生素，由于其在人類醫(yī)學和獸藥學上有效地預防和治療各種傳染性疾病而備受關注。青霉素屬于β-內酰胺類抗生素，由于其藥效高、價格低廉、使用方便，已成為臨床上治療細菌感染最常用的抗生素，在畜牧獸醫(yī)水產養(yǎng)殖領域也得到了廣泛的應用。目前主要用于治療奶牛乳腺炎、魚、蝦細菌感染和海參的疾病[1]。然而，用藥不規(guī)范對漁業(yè)生產和生態(tài)環(huán)境都有嚴重的潛在危害，也會導致藥物在奶和動物、水產品組織中的殘留，使人體產生耐藥性導致免疫力降低，也會使過敏個體存在潛在的風險，從而危害人體健康[2]。同時，抗生素殘留也成為國際貿易的壁壘[3]。我國農業(yè)部235號公告規(guī)定芐星青霉素在動物源組織中的限量值為50 μg/kg、苯唑西林為300 μg/kg，歐盟指令NO.2377/90/EEC對青霉素類抗生素在動物源性食品中的殘留進行了嚴格限制。所以對動物源性食品中此類抗生素殘留的有效監(jiān)測已經成為保障食品安全的一個重要環(huán)節(jié)。為滿足殘留檢測的需要，建立一種動物源性食品中青霉素類抗生素殘留的分析方法非常重要。

青霉素類藥物殘留的檢測方法一直以來都是科研人員關注的熱點，目前已報道的方法主要有微生物法[4]、免疫分析法[5-6]、近紅外光譜法[7]、拉曼光譜法[8]、高效液相色譜-紫外法[9-13]、高效液相色譜-熒光法[14]、高效液相色譜-化學發(fā)光法[15]、液相色譜-質譜法[16-19]、電泳法[20]等。其中，微生物法操作快速簡便、價格便宜，但專屬性不足，容易產生假陽性；免疫分析法由于要選擇配體發(fā)生結合反應，線性范圍窄，在檢測過程中也易產生假陽性；光譜法在定量方面存在缺陷；液相色譜-質譜法可避免生物法在準確性方面的欠缺，靈敏度高、選擇性強，但由于儀器價格昂貴，不能滿足絕大多數(shù)實驗室的需求。高效液相色譜法成為這類藥物殘留應用最廣泛的檢測技術，其準確性強、靈敏度高，能滿足青霉素類藥物殘留的痕量檢測需求。

本實驗旨在建立一種動物源性食品中青霉素G、苯唑西林、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素4 種青霉素類藥物的高效液相色譜檢測方法。采用乙腈-水提取目標化合物，HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜法對不同基質中4 種青霉素類藥物進行測定，并驗證了所建方法的選擇性、準確性、穩(wěn)定性和靈敏性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青霉素G鉀鹽（純度99.6%）、苯唑西林（純度91.0%）、乙氧萘青霉素（純度99.0%）、雙氯青霉素（純度97.5%）、水合氨芐青霉素（純度98.5%）德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；乙腈、甲醇（HPLC級） 美國Fisher公司；乙酸銨（色譜純） 北京Dikma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1260 Infinity高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）美國安捷倫公司；SCR20BA離心機 日本日立公司；RE52CS-2旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg，3 mL）、C18固相萃取柱（500 mg，3 mL） 美國Waters公司；HGC-36A氮吹儀天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備液的配制：準確稱取青霉素G、苯唑西林、乙氧萘青霉素和雙氯青霉素的標準品各10 mg（精確到0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為1.00 mg/mL的青霉素G、苯唑西林、雙氯青霉素和乙氧萘青霉素標準貯備液，于4 ℃以下避光保存。

標準工作液的配制：分別量取青霉素G、苯唑西林、雙氯青霉素和乙氧萘青霉素質量濃度為1.00 mg/mL標準貯備液各1.00 mL于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為10.0 μg/mL的4 種青霉素混合標準工作液，于4 ℃以下避光保存。

內標儲備液的配制：準確稱取水合氨芐青霉素標準品10 mg（精確到0.000 1 g）于10.0 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為1.00 mg/mL的水合氨芐青霉素標準貯備液，于4 ℃以下避光保存。

內標工作液的配制：量取1.00 mL 1.00 mg/mL水合氨芐青霉素標準貯備液于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為10.0 μg/mL的水合氨芐青霉素標準工作液。

1.3.2 高效液相色譜條件

C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0.00～3.00 min，87% A；3.01～10.0 min，87%～65% A；10.01～15 min，65%～87% A。流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃；紫外檢測波長210 nm。

1.3.3 樣品前處理

提?。簻蚀_稱取切碎均質良好的樣品2.00 g于50 mL離心管中，加內標工作液20 μL，靜置10 min，先加入2 mL水，再加入20 mL乙腈，渦旋混勻30 s，振蕩提取15 min，12 000 r/min離心5 min，將上清液全部轉移至旋蒸瓶中，向殘渣中再加水1 mL、乙腈10 mL渦旋混勻，二次提取，將上清液全部轉移到旋蒸瓶中。在旋蒸瓶中加入0.1 mL飽和食鹽水，于45 ℃水浴旋蒸至近干，加入3 mL正己烷，渦旋混勻，除去上層正己烷，剩余液體為固相萃取上樣液。

換熱站供熱節(jié)能改造工程一般包括以下內容：（1）加裝或更換一次網控制閥、熱量表、遠傳水表和電表，將換熱站內熱、水、電的能源消耗情況進行獨立的統(tǒng)計，建立能耗統(tǒng)計和分析系統(tǒng)，監(jiān)測換熱站的能耗情況，并制定運行調整方案。（2）二次管網加裝電動或手動平衡閥，通過其調節(jié)性能，提高二次管網的輸配效率，同時消除管網末端供暖質量問題，減少因供暖質量引起的人為放水。（3）站內水泵變頻和PLC控制柜改造，完善站內自動控制系統(tǒng)，增加水泵、閥門的運行調節(jié)方式，加裝或利用站內原有溫度、壓力測點進行數(shù)據采集。實現(xiàn)一次網閥門多控制方式選擇，同時滿足上位系統(tǒng)調整需求。典型換熱站節(jié)能改造示意圖如圖1所示。

凈化：將上樣液轉移到HLB固相萃取柱中（使用前用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL pH 8.5的磷酸鹽緩沖液活化），再用3 mL磷酸鹽緩沖液洗滌雞心瓶2 次，洗液一并轉移到萃取柱中；再用3 mL水淋洗并抽干萃取柱，用2 mL甲醇＋2 mL乙腈洗脫并收集于5 mL帶刻度的玻璃瓶中，50 ℃氮吹至小于1 mL，用乙腈定容至1 mL，渦旋混合，過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜分析。對每一個待測樣品平行測定3 次，取平均值。

1.4 數(shù)據處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（ANOVA），數(shù)據以 ±s表示，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

由于青霉素類化合物在弱酸性條件下易水解，水解產物中含有巰基、羰基等，易與金屬離子形成絡合物，國標[21]和文獻[22]因此采用衍生化法測定此類化合物。但會用到氯化汞等毒性物質，操作也較為復雜。而青霉素類化合物是β-內酰胺類，具有苯環(huán)、羰基等發(fā)色基團，在紫外波長范圍內有吸收峰。故本實驗采用直接進樣法檢測這類化合物。

青霉素類藥物由于具有不穩(wěn)定的四元環(huán)，易發(fā)生反應。用外標法測定時，回收率較低，故本實驗選取性質接近的水合氨芐青霉素作為內標物用以提高回收率。

本實驗在大量文獻和前期工作的基礎上，對比乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動相，標準物質出峰的半峰寬、分離度、保留因子等參數(shù)情況。結果表明：采用乙腈-水為流動相進行實驗時，溶劑峰嚴重拖尾，且化合物不出峰，原因可能是流動相中不含鹽，與固定相無保留；在流動相中加入鹽后，化合物與固定相作用，可以正常出峰，但乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液為流動相時，色譜峰的半峰寬大于乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相時的峰寬；加大鹽的濃度，峰形變窄，變尖。但考慮到鹽濃度增大在色譜柱中易結晶，影響色譜柱壽命，本實驗選取乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動相。

以不同體積比的0.02 mol/L磷酸二氫鉀-乙腈溶液作為流動相，考察4 種青霉素混合標準溶液的出峰時間。流動相比例為0.02 mol/L磷酸二氫鉀-乙腈（70∶30，V/V）溶液等度洗脫，在12 min內可完成分離，如圖1A所示。但內標峰水合氨芐青霉素在2.6 min左右出峰，青霉素G出峰時間在3.8 min左右，出峰時間較早。因動物源食品成分復雜，可能會對水合氨芐青霉素、青霉素G的分析產生干擾。因此本實驗選取梯度洗脫，洗脫程序如1.3節(jié)所述，分離效果圖見圖1B。出峰順序依次為水合氨芐青霉素、青霉素G、苯唑西林、乙氧萘青霉素和雙氯青霉素。

圖1 等度洗脫（A）和梯度洗脫（B）色譜圖Fig. 1 Chromatograms obtained by isocratic elution (A) and gradient elution (B)

2.2 提取條件的選取

2.2.1 提取溶劑的選擇

參照文獻方法，本實驗比較了乙腈[23]、乙腈-水（10∶1，V/V）[24]、乙腈-水（4∶1，V/V）[19]、丙酮-水（1∶1，V/V）[25]作提取溶劑，其他條件如1.3.3節(jié)所述，加標量在50 μg/kg時的回收率，結果見圖2。用乙腈和乙腈-水（10∶1，V/V）作提取溶劑時，回收率均在90%左右，后者回收率略高，其他2 組回收率較低?？赡苁怯捎谝译嫣崛r沉淀蛋白完全，易于離心分離，提前加入水能先溶解目標化合物。故本實驗選取乙腈-水（10∶1，V/V）作為提取溶劑。減壓蒸餾過程中加入飽和食鹽水，可以防止乙腈在旋蒸過程中暴沸[24]。

2.2.2 SPE柱的選擇

由于動物源性食品基質復雜，選用SPE凈化小柱獲得較好的凈化效果。青霉素類化合物分子中含有羥基，顯酸性，易溶于甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑。文獻中廣泛采用的是。本實驗比較了這2 種SPE柱在相同條件下的回收率。加標量為50 μg/kg，3 mL甲醇、3 mL水活化，上樣，水淋洗后抽干，最后用2 mL甲醇+2 mL乙腈洗脫，N2吹干后乙腈復溶。如圖3所示，HLB柱對目標化合物的回收率均高于C18柱，與文獻[24-25]報道結果一致。

圖3 不同SPE柱的回收率Fig. 3 Effect of different SPEs on recovery of penicillins

2.2.3 SPE洗脫條件的優(yōu)化

不同的淋洗和洗脫溶劑也影響了SPE柱的凈化效果。本實驗在文獻的基礎上，比較不同的淋洗和洗脫溶劑對回收率的影響，如表1所示。

表1 SPE洗脫條件的優(yōu)化Table 1 Optimization of SPE conditions

從表1可以看出，洗脫液為2 mL甲醇+2 mL乙腈時，4 種化合物的回收率明顯提高。當在活化和淋洗劑中加入堿性磷酸緩沖鹽時，回收率達到了90%左右?？赡苁菈A性磷酸鹽緩沖液防止待測物降解[12]。最終確定SPE萃取小柱的最佳條件為：選取HLB萃取柱，采用方案4的方式凈化。

2.3 方法的驗證

2.3.1 標準曲線、檢出限和定量限結果

配制質量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 μg/mL 6 個水平4 種青霉素的標準混合溶液，含內標0.20 μg/mL，待高效液相色譜分析。每個溶液分別進樣3 次，以目標化合物與內標質量濃度之比對其峰面積之比繪制4 種青霉素標準曲線，其中X為青霉素與內標物的質量濃度比，Y為二者峰面積之比。從表2可以看出，各目標化合物標準曲線的相關系數(shù)均大于0.999，顯示了良好的相關性。檢出限和定量限采用空白樣品中添加青霉素類化合物的方法，分別以信噪比不小于3和信噪比不小于10計算。從表2可以看出，各青霉素的檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，可以滿足青霉素類化合物的定性及定量測定要求。

表2 4 種青霉素的標準曲線及其相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, calibration curves, LODs and LOQs for four penicillins

2.3.2 精密度測定結果

在空白豬肉樣品中進行精密度實驗，樣品添加不同含量的標準溶液后，渦旋混勻，于室溫放置10 min，使待測成分與樣品機體成分互相作用達到平衡，按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述方法，做6 次重復實驗，測定結果的相對標準偏差在10%以內。

表3 精密度實驗（n=6）Table 3 Results of precision test (n=6)

2.3.3 回收率測定結果

在空白樣品中分別加入低、中、高3 個質量濃度的標準品進行回收率計算，選擇分別加入10、50、200 μg/kg 4 種青霉素混合標準工作液，利用上述確定的檢測方法，每個加標量做3 次平行實驗。由表4可知，在不同的基質中，3 個水平的回收率在69.9%～100.3%范圍內。從精密度和回收率的結果可以得出，該方法有較高的準確性和可靠性。

表4 4 種青霉素低、中、高3 個水平的回收率Table 4 Recovery rates for four penicillins at three different spiked levels

2.3.4 實際樣品驗證

從市場中選取5 種基質進行方法驗證，分別為豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、草魚，目標化合物出峰處均無干擾、未檢測出4 種青霉素類藥物殘留。

3 結 論

本實驗以水合氨芐青霉素作為內標，建立一種高效液相色譜法檢測動物源性食品中的青霉素G鉀鹽、苯唑西林、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素4 種青霉素類藥物殘留量的方法。采用直接進樣，無需衍生化，內標法定量提高了回收率。該方法前處理簡單、快速、準確、靈敏，可以滿足實際檢測分析的需要。