烘焙對紅松種籽衣活性成分含量及抗氧化活性的影響

郭奇泳，張艷，石茂軍，張琪瑤，吳聰，趙玉紅

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

紅松（Pinus koraiensis）屬裸子植物，又名海松，主要分布于小興安嶺地區(qū)，是我國重要的林業(yè)資源，紅松中含有豐富的多酚類物質[1]，這些物質已被證明具有抗氧化、抗癌、抗炎、防輻射和對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶具有抑制作用等功效[2～6]。有關紅松中活性成分的研究主要集中在對種殼、種鱗和種籽衣中多酚、黃酮、多糖等活性成分的提取及功能活性方面的研究[7～9]。

松仁外層包裹的膜衣稱為種籽衣。趙起越等[10]對紅松種籽衣的各種營養(yǎng)成分進行了測定，證明種籽衣中含有豐富的多酚和黃酮類化合物。張根生等[11]優(yōu)化紅松種籽衣中多酚的提取工藝。蘇曉雨等[12]對紅松種籽衣提取物的抗氧化作用進行了評價，證明紅松種籽衣提取物具有明顯的抗氧化活性并認為其優(yōu)良的抗氧化性與多酚及黃酮等活性成分相關。

種籽衣作為松仁加工產品副產物因含有活性成分和具有生物活性而被加入到食品中，趙夢雅等[13]將松仁種籽衣應用于酸奶中并研究其對酸奶理化性質的影響，Н.Н.Типсина等[14]將松籽衣添加到面包制品中。松籽常被用來烘焙后食用，Schl?rmann等[15]研究證明將榛子、杏仁和夏威夷果在低中溫（120～160 ℃）條件下烘焙具有更好的風味和營養(yǎng)價值。而烘焙處理對紅松種籽衣中活性成分含量和抗氧化活性產生的影響尚未見報道。

本研究對帶殼和不帶殼紅松松籽進行烘焙處理，取種籽衣，選擇烘焙溫度為130 ℃，研究烘焙時間對其種籽衣中總多酚、總黃酮活性成分含量、抗氧化能力（DPPH·清除能力、羥基自由基清除能力和總還原力）及顏色變化的影響，為更好地利用紅松種籽衣提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

紅松松籽，黑龍江省林業(yè)科學院提供。

1.1.2 試劑

無水乙醇、沒食子酸標準品、福林酚試劑、蘆丁標準品、DPPH、脫氧核糖、三氯乙酸、PBS、抗壞血酸、TPTZ均為分析純。

1.1.3 儀器與設備

756型紫外分光光度計，上海分析儀器廠；YP410047電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；DK-SD電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；KQ-300DE數控超聲波清洗器，昆明市超聲儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；SW-CJ-IFD型超凈工作臺；TDL-40B-W臺式低速大容量離心機，上海習仁科技儀器有限公司；遠紅外線食品燒烤爐。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 種籽衣的制備

帶殼烘焙種籽衣的制備：將完整松籽在130 ℃條件下烘焙，取出冷卻至室溫。將松籽剝殼，手工去皮得到種籽衣，密封，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

不帶殼烘焙種籽衣的制備：將松籽去殼，在130 ℃條件下烘焙，取出冷卻至室溫。手工從松仁表面剝離種籽衣，密封，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 提取液的制備

種籽衣經粉碎機粉碎，過 40目篩[11]，精確稱取種籽衣粉末。按料液比1：20（W/V）加入60%（V/V）乙醇溶劑，進行超聲波輔助提取，提取溫度 60 ℃，功率300 W，時間90 min[11]。離心（4000 r/min，20 min），分離提取液，殘渣復提一次，合并兩次提取液。

1.2.2 總多酚含量測定

采用Folin-Phenol法測定提取物總多酚含量。

1.2.2.1 標準曲線的繪制

參照張根生等[11]的方法，以沒食子酸為對照品。沒食子酸標準儲備溶液（1000 μg/mL）：稱取（0.11±0.01）g沒食子酸（GA，相對分子質量188.14）于100 mL容量瓶中溶解并定容至刻度，搖勻(現配)。沒食子酸工作液：用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的沒食子酸標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，分別用水定容至刻度，搖勻，濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL。用移液管分別移取沒食子酸工作液、水(做空白對照)各1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，分別加入5.0 mL福林酚試劑（10%，V/V），搖勻。反應3～8 min內，加入4.0 mL Na2CO3溶液（7.5%，m/V），充分混勻后定容。置于25 ℃恒溫水浴中反應1 h后，用比色皿于765 nm波長下測定吸光值。以沒食子酸的質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線。沒食子酸在0～50 μg/mL濃度范圍內線性回歸方程為y=0.0161x+0.029，R2=0.9993。

1.2.2.2 樣品的測定

取1 mL稀釋提取液，按上述方法測定總多酚的含量，公式如下：

式中：V為稀釋提取液的體積（mL）；N為稀釋倍數；C為按標準曲線計算的溶液的總多酚濃度（mg/mL）；m為樣品的質量（g）。

1.2.3 總黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定提取物總黃酮含量。

1.2.3.1 標準曲線的繪制

參照張曉茹等[16]的方法，以蘆丁為對照品。精密稱取蘆丁對照品20 mg用少量60%乙醇溶解后，轉移至100 mL容量瓶，定容至刻度線。分別精密量取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL蘆丁溶液置于試管中，加入0.5 mL亞硝酸鈉溶液（5%，W/V），搖勻，靜置6 min，加入0.5 mL硝酸鋁溶液（10%，W/V），搖勻，靜置6 min，加入5 mL氫氧化鈉溶液（4%，W/V），搖勻，加入60%乙醇定容至10 mL，靜置25 min，在509 nm波長處測定吸光值，以蘆丁濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。蘆丁在0～70 μg/mL濃度范圍內線性回歸方程為 y=0.0118x-0.0014，R2=0.9991。

1.2.3.2 樣品的測定

取1mL稀釋提取液，按上述方法測定總黃酮的含量，計算公式如下：

式中：V為稀釋提取液的體積（mL）；N為稀釋倍數；C為按標準曲線計算的溶液的總黃酮濃度（mg/mL）；m為樣品的質量（mg）。

1.2.4 抗氧化能力測定1.2.4.1 DPPH·清除能力測定

參照張曉茹等[16]的方法，用無水乙醇將DPPH樣品配置為0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，并保存于棕色瓶中（臨用前配）。取測定液2 mL及2 mL DPPH溶液到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30 min后測定其在波長517 nm下吸光度A1，同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液吸光度A0，以及2 mL測定液與2 mL無水乙醇混合液吸光度A2。自由基清除能力的計算公式：

1.2.4.2 羥基自由基清除能力測定

參照 Siddhuraju[17]的方法并做修改。取 0.25 mL提取液，0.25 mL蒸餾水做空白對照。樣品中加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，100 mmol/L）、0.2 mL 2-脫氧-D-核糖（28 mmol/L）、0.4 mL Fe3+-EDTA（100 μmol/L FeCl3，104 μmol/L Na2-EDTA 1：1）、0.2 mL H2O2（1 mmol/L）和0.2 mL抗壞血酸溶液(1 mmol/L)。在37 ℃水浴下反應1 h，立即加入，加冰的三氯乙酸（2.8%，W/V）和2 mL 2-硫代巴比妥酸（1%，W/V），沸水浴20 min，待樣品冷卻（10 min），于532 nm波長下測定個樣品吸光值，平行測定三次，計算清除率。

式中：A1：加測定溶液后的吸光度；A2：加測定溶液，不加脫氧核糖溶液反應后的吸光值；A3：未加測定溶液時的吸光度。

1.2.4.3 總還原力測定

采用FRAP法，參照Bouayed等[18]的方法并做修改，向試管中加入5 mL TPTZ（用40 mmol/L HCl配制成濃度為10 mmol/L的溶液）和0.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液混合均勻，于37 ℃水浴中水浴加熱5 min后，加入0.5 mL待測液搖勻，繼續(xù)37 ℃水浴10 min，取出靜置至室溫后于593 nm波長下測定吸光值。

標準曲線繪制：配制FeSO4濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L作為待測液，按上述方法測定吸光值。FeSO4在0～1.0 mmol/L濃度范圍內線性回歸方程為 y=0.6776x+0.0437，R2=0.9991。

1.2.5 種籽衣色差值的測定

亮度值L*、紅綠值a、黃藍值b的測定參照靜瑋等[19]的方法。

1.2.6 種籽衣提取液全波長掃描

以60%乙醇溶液作基線，提取液稀釋10倍后在紫外分光光度計進行全波長掃描。

1.3 數據處理

采用origin8.0繪圖，采用SPSS20.0對數據進行相關性分析、顯著性檢驗，所得結果用平均值±標準差（±sd）表示，以p＜0.05作為差異顯著性檢驗標準。

2 結果與分析

Schl?rmann等[15]研究證明低溫（120～140 ℃）烘焙條件下堅果具有最高的感官評價分數。因此本實驗選擇在130 ℃進行烘焙處理。

2.1 總多酚含量測定結果

在 130 ℃條件下分別對帶殼、不帶殼松籽烘焙10、20、30、40 min，種籽衣多酚含量測定結果如圖1所示。與未烘焙種籽衣相比，種籽衣經過不同條件烘焙后總多酚含量呈現不同程度的損失。其中，帶殼烘焙種籽衣在10 min總多酚含量降到最低，繼續(xù)烘焙總多酚含量又會上升隨后再繼續(xù)下降；不帶殼烘焙的種籽衣總多酚含量在30 min時下降到最低，繼續(xù)烘焙總多酚含量上升。

未處理種籽衣提取液總多酚含量為11.31 mg/g，較趙夢雅等[13]16.20 mg/g有所降低，可能與松子成熟度、季節(jié)、儲存和處理條件以及干燥方法等因素相關；Bradleyw等[20]將加利福尼亞杏仁種籽衣在295 ℉條件下烘焙14 min，總多酚含量由25.10 mg/g下降至18.50 mg/g，本研究種籽衣在烘焙過程中總多酚含量也呈現不同程度的降低（p＜0.05）。Locatelli等[21]等研究了180 ℃烘焙10 min和20 min對榛子種籽衣總酚含量的影響，結果顯示種籽衣在烘焙20 min時總酚含量顯著高于10 min，與本研究帶殼烘焙情況類似。Pelvan等[22]的研究表明，沒食子酸和香草酸是天然榛子皮中的主要酚酸，而在烘焙后的榛子皮中，香草酸和丁香酸占主導地位，以此推斷，烘焙紅松種籽衣中酚酸種類發(fā)生變化，即烘焙過程中伴隨著原有酚酸喪失和新酚酸生成反應的進行，可能是烘焙過程中總多酚含量在20 min（帶殼）和40 min（不帶殼）時升高的原因。

圖1 烘焙種籽衣總多酚含量與時間關系Fig.1 Relationship between total polyphenol content and time of baked seed coat

2.2 總黃酮含量測定結果

在130 ℃條件下分別進行帶殼、不帶殼烘焙10、20、30、40 min，種籽衣總黃酮含量測定結果如圖 2所示。與未烘焙種籽衣相比，種籽衣經過不同條件烘焙后總黃酮含量呈現不同程度的損失，其中，帶殼焙烘焙種籽衣在20 min總黃酮含量較10 min略微上升后，繼續(xù)烘焙總黃酮含量又會下降；不帶殼烘焙的種籽衣總黃酮含量在10～30 min時間段呈現上升趨勢，隨后在40 min時降到最低。

未處理種籽衣總黃酮含量為3.05 mg/g，比較吳瓊等[23]研究結果有所降低。本研究按提取多酚的最佳工藝測定總黃酮含量，與吳瓊等[23]最佳工藝不同，應是黃酮提取含量低的主要原因。帶殼烘焙總黃酮含量普遍低于不帶殼烘焙，應是松子殼阻礙了種籽衣直接暴露在空氣中，從而阻礙了分解反應的進行。

圖2 烘焙種籽衣總黃酮含量與時間關系Fig.2 Relationship between the content of total flavonoids and the time of baking seed coat

2.3 紅松種籽衣抗氧化性測定結果

2.3.1 DPPH·清除能力研究

不同濃度帶殼、不帶殼烘焙種籽衣提取液對DPPH·清除能力影響結果分別見表 1和表 2。由DPPH·清除能力的半抑制濃度（IC50）可知，帶殼烘焙過程中，DPPH·清除能力在20 min時上升隨后繼續(xù)下降，在 20 min時達到最高；不帶殼烘焙過程中，DPPH·清除能力在20 min和40 min上升，在20 min時最高。其中不帶殼烘焙20 min的DPPH·清除能力最高，IC50值為0.16 mg/mL，低于未烘焙樣品IC50值0.17 mg/mL，說明其DPPH·清除能力高于未烘焙樣品。

DPPH·清除率在提取液濃度為 0.05～0.80 mg/mL范圍內隨濃度增大而升高，且同一濃度不同烘焙時間的提取液清除率差異明顯（p＜0.05）。當提取液濃度達到0.80 mg/mL時，DPPH·清除率可高達89.39%（不帶殼烘焙20 min）和90.71%（不帶殼烘焙40 min）。

表1 帶殼烘焙種籽衣不同濃度提取液的DPPH自由基清除率Table 1 DPPH radical scavenging rates of different concentration extracts of shell-baked seed coats

表2 不帶殼烘焙種籽衣不同濃度提取液的DPPH自由基清除率Table 2 DPPH radical scavenging rates of different concentration extracts of seed coats without shell baking

2.3.2 羥基自由基清除能力研究

不同濃度帶殼、不帶殼烘焙種籽衣提取液對羥基自由基清除能力影響結果分別見表3和表4。由羥基自由基的半抑制濃度（IC50）可知，烘焙后的種籽衣的提取液對羥基自由基的清除能力在 20 min時呈現大幅度的上升，帶殼烘焙IC50值從0.19 mg/mL降低至0.11 mg/mL，不帶殼烘焙IC50值從0.14 mg/mL降低至 0.10 mg/mL，都比未處理種籽衣 IC50值（0.14 mg/mL）低。同樣情況出現在40 min時也出現，但清除能力不如未處理種籽衣。且不帶殼烘焙的種籽衣對羥基自由基的清除能力較帶殼烘焙的種籽衣強。其中不帶殼烘焙20 min清除能力最強。

羥基自由基清除率在提取液濃度為 0.10～2.00 mg/mL范圍內隨濃度增大而升高，即兩者呈現明顯的量效關系，且同一濃度不同烘焙時間的提取液清除率差異明顯（p＜0.05）。當提取液濃度達到 2.00 mg/mL時，羥基自由基清除率可高達 91.03%（不帶殼烘焙20 min）。

表3 帶殼烘焙種籽衣不同濃度提取液的羥基自由基清除率Table 3 Hydroxyl radical scavenging rates of different concentration extracts of shell-baked seed coats

表4 不帶殼烘焙種籽衣不同濃度提取液羥基自由基清除率Table 4 Hydroxyl radical scavenging rates of different concentration extracts of seed coats without shell baking

2.3.3 總還原力研究

烘焙種籽衣提取液總還原力測定結果如圖 3所示。烘焙后種籽衣總還原能力不如未烘焙種籽衣，不同烘焙時間條件呈現不同程度的降低。帶殼烘焙過程中還原力逐漸減弱，未烘焙種籽衣提取液為 4.51 mmol/L（以FeSO4為當量，下同），帶殼烘焙40 min時為2.32 mmol/L；不帶殼烘焙過程中總還原力在20 min和40 min時有較大幅度的上升，其中20 min時為3.74 mmol/L，40 min時為3.69 mmol/L。

從圖中可以看出，烘焙后種籽衣總還原能力不如未烘焙種籽衣，這與Bradleyw等[20]的研究結果相同，因此是否帶殼進行烘焙會影響種籽衣的總還原能力。在烘焙時間20 min以后（包括20 min），不帶殼總還原力明顯高于帶殼。活性成分含量變化說明烘焙過程中存在著新物質的生成[22]，而顏色變化說明烘焙過程中存在美拉德反應，這與 Davis等[24]推測相同。在低中溫130 ℃烘焙條件下，殼的存在阻礙種籽衣直接接觸熱空氣，從而阻礙兩種反應的進行，應是帶殼烘焙種籽衣抗氧化性（DPPH·清除能力、羥基自由基清除能力、總還原力）不如不帶殼烘焙種籽衣的原因。

圖3 烘焙種籽衣總還原力與烘焙時間關系圖Fig.3 Relationship between total reducing power and baking time of baked seed coat

2.4 烘焙種籽衣顏色變化研究

L*、a、b值測定結果如圖4。烘焙0～40 min過程中，a值呈現先升高再降低而后繼續(xù)升高的趨勢，且a不帶殼＞a帶殼；b值持續(xù)降低，30 min后降低速度趨于平緩；L*值持續(xù)降低，30 min后降低速度趨于平緩，且L*帶殼＞L*不帶殼。說明烘焙過程中伴隨著呈色物質的分解和生成，且對不帶殼種籽衣影響更為劇烈。Davis等[24]研究了烘焙（166 ℃，0～77 min）對花生種籽衣顏色的影響，表明在烘焙過程種籽衣顏色明顯變暗，并推測是由烘焙過程中美拉德反應引起的。

紅松種籽衣中含有較為豐富的蛋白質和糖類[10]，在烘焙過程中伴隨著美拉德反應（非酶褐變）和焦糖化反應的進行，結果生成黑色素，是烘焙過程中種籽衣顏色逐漸加深的原因，即L*值、a值、b值大幅度降低，烘焙30 min后，由于蛋白質和糖類逐漸被消耗，非酶褐變反應速度減慢，因而顏色變化程度降低。項惠丹等[25]研究表明美拉德反應生成的黑色素具有抗氧化活性，且與反應物濃度和反應時間有一定的量效關系，這也是烘焙過程中各指標變化不規(guī)律的原因。

圖4 a、b、L*值與烘焙時間變化關系Fig.4 Relationship between a, b, L* values and baking time

2.5 種籽衣提取液全波長掃描結果

帶殼、不帶殼烘焙種籽衣提取液全波長掃描結果如圖 5-a和圖 5-b。所有樣品吸收峰波長都位于274～279 nm之間。其中，未處理種籽衣提取液吸收峰波長為275.5 nm，吸光值為1.00；帶殼烘焙40 min種籽衣提取液吸收峰波長為275.0 nm,吸光值最高1.13；不帶殼烘焙20 min種籽衣提取液吸收峰波長為278.5 nm，吸光值為1.12。說明烘焙過程中活性成分種類以及含量是發(fā)生變化的。Alasalvar等[26]研究的榛子種籽衣提取物吸收峰波長為282 nm，說明兩者活性成分較為接近。

烘焙過程中特征吸收峰波長和吸光值都在變化，即烘焙過程中活性成分種類和含量都會發(fā)生變化。Alasalvar等[26]將榛子皮提取物在層析柱中用乙醇進行洗脫得到低分子量的酚酸，并做掃波長掃描分析，得到最大吸收峰波長為278 nm，與不帶殼20 min吸收峰波長接近，結合兩者分析，不帶殼烘焙20 min的紅松種籽衣提取物中應含有大量的低分子量酚酸，通過總多酚和總黃酮在10～20 min時變化情況，20 min較 10 min活性成分含量高或兩者差異不明顯（p＜0.05），由此可以推斷這個時間段是新的酚酸生成的主要階段，從而烘焙20 min時新的酚酸含量達到最高，隨后繼續(xù)烘焙新的酚酸也會喪失使總多酚含量減少，這可以為烘焙20 min時的高抗氧化性提供依據。類似的情況也可以在30～40 min時間段看到。

圖5 帶殼和不帶殼烘焙種籽衣全波長掃描圖Fig. 5 Full-wavelength scan of seed coats with and without shells

2.6 抗氧化活性與總多酚、總黃酮含量間的相關性

表5 活性成分與抗氧化指標間相關系數表Table 5 Correlation coefficient between active ingredients and antioxidant properties

為了研究活性成分含量與抗氧化活性之間是否存在量效關系，根據含量及IC50值計算了各指標間相關系數，總多酚、總黃酮含量分別對DPPH·和羥基自由基的相關系數分別為0.799和0.648，證明總多酚、總黃酮含量分別對 DPPH·清除能力和羥基自由基清除能力有正相關性。

3 結論

130 ℃烘焙不同時間對帶殼和不帶殼紅松種籽衣中活性成分和抗氧化性產生不同影響，適度烘焙的不帶殼紅松種籽衣的抗氧化能力顯著提升。烘焙后的紅松種籽衣中成分和性質的改變使其具有更高的利用價值，是酚類和天然抗氧化劑的很好來源，相比于未烘焙種籽衣更適合作為具有抗氧化功能的食品配料。