電針預(yù)處理腦保護(hù)作用機(jī)制研究進(jìn)展

寧文華，李禮,2,3，郭揚(yáng),2，張寶瑜，王洋，趙夢(mèng)雄，王舒,2,4

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津市 300381；2.國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市 300381；3.天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市 300381；4.國(guó)家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點(diǎn)研究室，天津市300381

腦卒中是全球致死和致殘的主要原因之一，其中缺血性腦卒中占85%[1]。重組組織纖維酶原激活物仍是目前唯一批準(zhǔn)用于缺血性腦卒中治療的藥物，但因其時(shí)間窗窄(4.5 h)、嚴(yán)格的適應(yīng)癥，僅能使部分患者受益[2]。大腦存在自我保護(hù)機(jī)制，能夠適應(yīng)諸如缺血等不良事件[3]；短暫的亞致死性刺激可以激活內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，誘導(dǎo)腦缺血耐受，抵抗或減輕隨后發(fā)生的缺血損傷，即缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IPC)[4]。

針灸“治未病”歷史悠久，早在《金匱要略》、《備急千金要方》等典籍中已有將針灸應(yīng)用于預(yù)防腦卒中的記載[5]，可激發(fā)人體正氣，增強(qiáng)抗病能力，防止疾病發(fā)生發(fā)展[6]。電針是傳統(tǒng)針灸與現(xiàn)代電刺激的結(jié)合，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、安全等特點(diǎn)，在缺血性腦卒中的臨床治療中應(yīng)用廣泛[7]。2003 年，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)腦缺血前重復(fù)電針刺激百會(huì)穴可以減輕腦缺血后神經(jīng)缺損程度，發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)[8]，提出電針預(yù)處理的概念。此后十余年里，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用機(jī)制開(kāi)展了廣泛研究。本文綜述電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦保護(hù)的作用機(jī)制。

1 調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system,eCBS)

eCBS 是由內(nèi)源性大麻素受體CB1R、CB2R，配體AEA、2-AG，以及負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)、合成、降解的蛋白質(zhì)組成的脂質(zhì)信號(hào)系統(tǒng)[9]，在調(diào)控神經(jīng)元存活方面有重要作用[10]。CB1R能夠激活缺血神經(jīng)元中的特定信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)元存活；CB2R 的激活可以減輕急性腦卒中后炎癥和白細(xì)胞浸潤(rùn)，改善腦損傷[11]。大麻素受體激動(dòng)劑對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[12]。

電針預(yù)處理后，大鼠腦內(nèi)CB1R、CB2R 分別于2 h、24 h內(nèi)明顯上調(diào)，參與缺血后快速或延遲腦保護(hù)作用[13]。電針預(yù)處理還可通過(guò)上調(diào)AEA、2-AG 表達(dá)，作用于CB1R，誘導(dǎo)腦缺血耐受[14]。激活CB1R 可誘導(dǎo)epsilon 蛋白激酶C (epsilon protein kinase C,εPKC)活化[15]，激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)信號(hào)通路[16]，促進(jìn)糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)磷酸化[17]，調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)磷酸化[18]。電針預(yù)處理作用于CB2R及其下游過(guò)程的研究較為欠缺。

2 抑制興奮毒性

腦缺血后，突觸前神經(jīng)元釋放大量谷氨酸；谷氨酸在突觸間隙堆積，與突觸后谷氨酸受體結(jié)合，導(dǎo)致鈣內(nèi)流，引發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成興奮毒性[19]。胞外谷氨酸的攝取主要依賴興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2 (excitatory amino acid transporter 2,EAAT2)，負(fù)責(zé)清除細(xì)胞外約90%谷氨酸[20]。抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)可通過(guò)突觸前或突觸后抑制作用，拮抗谷氨酸的興奮毒性作用[21]。

腦缺血再灌注后，EAAT2 表達(dá)降低，胞外谷氨酸濃度升高。電針預(yù)處理一方面促進(jìn)EAAT2 表達(dá)[22-23]，逆轉(zhuǎn)N-mcy 下游調(diào)節(jié)基因2 (N-mcy downstream regulated gene 2,NDRG2)上調(diào)，抑制STAT3 磷酸化[24]，減輕腦缺血損傷；另一方面，電針預(yù)處理上調(diào)腦缺血再灌注大鼠紋狀體GABA水平，降低胞外谷氨酸濃度，抑制興奮毒性，減輕缺血再灌注損傷[25]。突觸前神經(jīng)元谷氨酸分泌過(guò)程、突觸后神經(jīng)元谷氨酸受體結(jié)合過(guò)程以及相關(guān)調(diào)控環(huán)節(jié)在電針預(yù)處理中發(fā)揮的作用有待研究。

3 抑制氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是腦缺血后主要的神經(jīng)元損傷病理過(guò)程[26]，主要與自由基產(chǎn)生過(guò)多或抗氧化防御能力受損有關(guān)。電針預(yù)處理可以影響抗氧化酶表達(dá)，抵抗氧化應(yīng)激損傷。錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)是線粒體內(nèi)重要的抗氧化酶，可通過(guò)清除線粒體活性氧，減輕氧化應(yīng)激損傷。電針預(yù)處理通過(guò)CB1R 介導(dǎo)的STAT3 磷酸化，上調(diào)腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶Mn-SOD 表達(dá)，增強(qiáng)其抗氧化能力[27]。過(guò)氧化還原酶6 (peroxiredoxin 6,Prx6)屬于抗氧化蛋白超家族，可清除自由基，增強(qiáng)腦缺血再灌注后的抗氧化活性，抑制細(xì)胞凋亡[28]。腦缺血再灌注后24 h，Prx6 表達(dá)升高，電針預(yù)處理能夠進(jìn)一步上調(diào)Prx6表達(dá)，加速自由基清除，發(fā)揮腦保護(hù)作用[29]。

4 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和鈣儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所，參與維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。缺血缺氧等病理變化后，大量折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致ERS[30]。適當(dāng)?shù)腅RS 可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮保護(hù)作用；而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)或過(guò)度應(yīng)激，釋放大量毒性物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載，加重腦缺血損傷[31]。在應(yīng)激條件下，生長(zhǎng)停滯和DNA 損傷基因153 (growth arrest and DNA damage-inducible gene 153,GADD153)表達(dá)上調(diào)，參與ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡過(guò)程；而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)上調(diào)可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白負(fù)荷，恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[32-33]。陳懷龍等[33]發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理可促進(jìn)全腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)GRP78表達(dá)，降低GADD153表達(dá)，減輕ERS反應(yīng)。

未折疊蛋白反應(yīng)是ERS的常見(jiàn)類型，涉及蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6 (activating transcription factor 6,ATF6)和肌醇激酶1 (inositol requiring enzymel 1,IRE1)介導(dǎo)的3條信號(hào)通路，參與維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[34]。肖飛等[35]發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理能激活腦缺血再灌注大鼠IRE1-X 盒連接蛋白1 (X-box binding protein 1,XBP1)信號(hào)通路，緩解ERS，減輕腦缺血再灌注損傷。而電針預(yù)處理對(duì)于PERK、ATF6介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響仍然未知。

5 抑制炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是缺血性腦卒中的關(guān)鍵病理過(guò)程，是影響其預(yù)后的重要因素。腦缺血發(fā)生后，白細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放多種促炎因子，如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等，激活Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重腦損傷[36]。作為腦內(nèi)主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，不同小膠質(zhì)細(xì)胞表型在腦缺血中具有不同作用：腦缺血后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活，表現(xiàn)為M1 型，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重腦損傷；而M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌抗炎介質(zhì)，抑制炎癥反應(yīng)。

電針預(yù)處理能夠降低腦缺血再灌注損傷大鼠促炎因子IL-1β、IL-6表達(dá)[37-38]，調(diào)控促炎因子TNF-α與抗炎因子IL-10之間的動(dòng)態(tài)平衡[39]，下調(diào)缺血半暗帶TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor kappaB,NF-κB)表達(dá)水平[40]，對(duì)抗炎性反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。NF-κB 抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α,IκB-α)與NF-κB 結(jié)合并抑制其活性，牟傳琳等[41]發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理抑制海馬區(qū)IκB-α/NF-κB/細(xì)胞間黏附分子1 (intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)信號(hào)通路，減輕腦缺血再灌注損傷。電針預(yù)處理還可激活煙堿型乙酰膽堿受體α7 亞單位(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)[42]，抑制高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)釋放[43]，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，由M1 型轉(zhuǎn)化為M2 型，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用[44]。

根據(jù)現(xiàn)有研究，電針預(yù)處理抑制炎癥作用主要通過(guò)調(diào)控炎癥因子和小膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵調(diào)控者，同樣參與腦缺血損傷病理過(guò)程，電針預(yù)處理抗炎效應(yīng)是否與星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)及其機(jī)制均有待進(jìn)一步探究。

6 保護(hù)血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)

BBB是存在于血液與腦組織之間的屏障結(jié)構(gòu)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、緊密連接及其他細(xì)胞外基質(zhì)組成，參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)物質(zhì)交換，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[45]。緊密連接蛋白(tight junction protein,TJP)是BBB 的重要組成部分，包括Claudins、Occludin、ZO-1，參與維持BBB 完整性。層粘連蛋白(lamina,LN)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，與BBB 通透性的改變有關(guān)[46]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、膜泡運(yùn)輸、活性氧等多種因素參與破壞BBB 結(jié)構(gòu)及功能，影響腦缺血預(yù)后或出血轉(zhuǎn)化[47]。

電針預(yù)處理可通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)，減輕TJP降解[48]，降低還原型輔酶Ⅱ氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)減少活性氧生成，下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4 (aquaporin 4,AQP4)、LN 表達(dá)，上調(diào)ZO-1、Claudin-5表達(dá)，維持BBB完整性[49-50]。對(duì)腦缺血再灌注大鼠的研究發(fā)現(xiàn)[51-53]，7 d 和15 d 電針預(yù)處理均可促進(jìn)Claudin-5 表達(dá)，抑制MMP-9、AQP4 及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)，降低腦含水量和BBB通透性，以電針預(yù)處理15 d更佳。

7 抑制細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡形式，受Bcl-2、p53等多種凋亡基因調(diào)控。其中，Bcl-2 家族是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括以Bcl-2 為代表的抗凋亡蛋白和以Bax 為代表的促凋亡蛋白兩大類。Bcl-2 與Bax 作用形成異源二聚體，抑制Bax活化，是Bcl-2抗凋亡的重要機(jī)制[54]，二者的比值決定凋亡是否發(fā)生。

電針預(yù)處理可上調(diào)腦缺血再灌注大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)表 達(dá)[55]，升高Bcl-2/Bax 比值，降低p53 表達(dá)[56]，抑制細(xì)胞凋亡，且其抗凋亡作用的發(fā)揮與激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)[57]。腦缺血再灌注損傷后動(dòng)力相關(guān)蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)表達(dá)增加，線粒體超微結(jié)構(gòu)受損，神經(jīng)元凋亡增加；電針預(yù)處理抑制Drp1 活性，從而抑制神經(jīng)元凋亡[58]。

8 調(diào)節(jié)自噬

自噬是一把雙刃劍，一方面通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分的清除及再利用促進(jìn)細(xì)胞存活，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；另一方面，持續(xù)過(guò)度自噬超過(guò)細(xì)胞適應(yīng)能力，參與細(xì)胞死亡過(guò)程[59]。

自噬受諸多因素的影響，其在缺血和再灌注階段作用機(jī)制并不相同，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)局的影響也存在差異。Wu等[60-61]分別觀察電針預(yù)處理對(duì)腦缺血期和再灌注期自噬的調(diào)控作用，在腦缺血期，電針預(yù)處理通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路，激活自噬；而在再灌注期，電針預(yù)處理減少自噬體數(shù)量，降低自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I比值；給予自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可部分逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用，提示再灌注期電針預(yù)處理可能通過(guò)抑制自噬發(fā)揮腦保護(hù)作用。周文婷等[62]建立腦缺血再灌注小鼠模型同樣發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理能夠激活海馬區(qū)mTOR、磷酸化mTOR蛋白表達(dá)，抑制自噬，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

目前的研究多以神經(jīng)元自噬為中心，腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等其他類型細(xì)胞的自噬流，以及線粒體自噬同樣與缺血性腦卒中病理過(guò)程密切相關(guān)，未來(lái)可從這一方向繼續(xù)開(kāi)展研究，綜合分析自噬與電針預(yù)處理腦保護(hù)的關(guān)系。

9 小結(jié)

針灸治療具有整體性的特點(diǎn)，電針預(yù)處理效應(yīng)的發(fā)揮并不局限于某單一靶點(diǎn)或病理過(guò)程。根據(jù)現(xiàn)有研究，電針預(yù)處理可作用于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等多靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)eCBS、抑制興奮毒性、抑制氧化應(yīng)激、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)血腦屏障、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)自噬多水平發(fā)揮腦保護(hù)作用。

充分的臨床前研究是成功進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的前提。我們需要結(jié)合研究現(xiàn)狀考量更多因素，以指導(dǎo)后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化。①不同環(huán)節(jié)的關(guān)聯(lián)性：目前的研究多關(guān)注缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的單一致病環(huán)節(jié)，但缺血性腦卒中病理機(jī)制復(fù)雜，單一神經(jīng)保護(hù)策略未必可行，未來(lái)研究需著眼于各病理過(guò)程之間相互聯(lián)系，各細(xì)胞之間相互影響，如ERS誘導(dǎo)自噬、神經(jīng)血管單元等。②時(shí)間窗：目前研究多集中于電針預(yù)處理作用機(jī)制，其效應(yīng)持續(xù)時(shí)間尚未明確，未來(lái)可關(guān)注電針預(yù)處理確切的保護(hù)時(shí)間窗，并分析其相應(yīng)機(jī)制，優(yōu)化電針穴位、參數(shù)和干預(yù)周期等，為臨床轉(zhuǎn)化提供參考。③研究模型與目標(biāo)人群一致性：現(xiàn)有研究工作通常選用幼年鼠，與缺血性腦卒中多發(fā)生于中老年人的臨床現(xiàn)實(shí)不符，是否會(huì)造成基礎(chǔ)研究及臨床轉(zhuǎn)化的差異，也需要進(jìn)一步探索。