腸球菌生物被膜研究進展

丁 麗， 林東昉

生物被膜（biofilms）是指細菌在生長過程中附著于生物體表面（如傷口表面）或非生物體表面（導尿管、中心靜脈導管、人工心臟瓣膜等醫(yī)用植入裝置），由自身產(chǎn)生的胞外聚合物（包括核酸、蛋白質(zhì)、多糖和脂類）包裹細菌組成的一個細菌群體。生物被膜的形成為細菌提供了保護作用，生物被膜抵抗抗生素作用以及宿主免疫防御，并涉及許多細菌和真菌慢性感染[1]。

腸球菌是一種重要的條件致病菌，主要包括糞腸球菌和屎腸球菌，能夠引起尿路感染、腹腔感染、血流感染以及感染性心內(nèi)膜炎，尤其是免疫功能低下的患者[2]。根據(jù)2017 年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測顯示，腸球菌在醫(yī)院分離革蘭陽性臨床菌株中位列第二，其中，糞腸球菌占42.3%，屎腸球菌則占50.7%[3-4]。現(xiàn)有資料顯示，高達65%～80%感染與生物被膜形成有關(guān)，突出了其巨大的臨床影響[5]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腸球菌生物被膜的形成是尿路感染、心內(nèi)膜炎等感染慢性化的重要原因[6]。本文主要介紹腸球菌生物被膜的最新研究進展及其臨床意義。

1 腸球菌生物被膜及其流行性

1.1 生物被膜的形成

生物被膜形成是一個多階段的過程，主要包括黏附、成熟以及脫落三個過程[7]。首先，細菌可逆性附著于生物體或者非生物體表面，隨后細菌自身誘導產(chǎn)生的胞外聚合物使得細菌更加堅固地聚集在一起，其結(jié)構(gòu)提供了一個最佳的微環(huán)境，促進細菌之間遺傳因子的傳播，當生物被膜內(nèi)微環(huán)境出現(xiàn)不利因素（缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)不足等）時，細菌從生物被膜中脫落，隨血流等進入循環(huán)系統(tǒng)，引起血流感染，同時能黏附在機體其他部位，再次形成生物被膜[6，8]。

腸球菌通常具有很強的生物被膜形成能力，其中糞腸球菌較屎腸球菌具有更高的生物被膜形成能力，且兩者的流行程度在區(qū)域上有所不同。研究顯示，歐洲地區(qū)糞腸球菌具有很高的生物膜形成能力，英國109株腸球菌血液分離株中，100%糞腸球菌具有形成生物被膜的能力，42%屎腸球菌可形成生物被膜[9-10]。美洲的糞腸球菌分離株也同樣具有很高的生物被膜形成能力，研究顯示不同來源的163株糞腸球菌分離物中有93%可形成生物被膜[11-12]。然而，分離自西班牙的糞腸球菌分離株只有57.2%具有形成生物被膜的能力，研究中39株屎腸球菌分離株不能產(chǎn)生生物被 膜[13]。

我國深圳某醫(yī)院265株糞腸球菌臨床分離株中47.2%具有形成生物被膜的能力[14]，在此之前浙江溫州某醫(yī)院348株腸球菌臨床分離株中有54.6%可形成生物被膜，其中糞腸球菌生物被膜形成率為75.6%，屎腸球菌生物被膜形成率為37.5%[15]。

1.2 生物被膜的組分

生物被膜主要由膜內(nèi)細菌、酶、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）、蛋白質(zhì)、胞外DNA（eDNA）以及水通道組成[16]。EPS形成的水合網(wǎng)絡促進細胞與細胞之間的黏附，并為生物被膜提供結(jié)構(gòu)支持。生物被膜EPS形成含有大量陰離子和陽離子分子的致密屏障，可以結(jié)合帶電荷的抗菌劑，并為微生物提供遮蔽，提高生物被膜內(nèi)細菌對抗生素的耐受性。

2 與腸球菌生物被膜形成相關(guān)的分子

2.1 毒力分子

目前普遍研究認為與腸球菌生物被膜形成相關(guān)的毒力分子主要包括溶細胞素（cytolysin）、聚集物質(zhì)（aggregation substance）、表面碳水化合物（surface carbohydrates）、細胞外超氧化合物（extracellular superoxide）以及表面蛋白（extracellular surface protein）等。

腸球菌表面蛋白是由染色體基因esp編碼的大分子表面蛋白，由1 873個氨基酸組成并具有N-末端結(jié)構(gòu)域，屬于Alp蛋白家族。ESP參與生物被膜形成，并且與尿路感染及心內(nèi)膜炎的發(fā)病機制有關(guān)。研究認為esp基因?qū)ι锉荒さ男纬捎泻艽笞饔茫Ｒ娪诰哂行纬缮锉荒つ芰Φ呐R床糞腸球菌中，esp基因能夠促進糞腸球菌在非生物體表面上初步附著和生物被膜形成[13]。但是又有部分學者認為esp基因?qū)τ谏锉荒さ男纬梢饬x不大[11，17-18]，或ESP不是生物被膜形成所必需的[11，19-20]。

明膠酶（GelE）是由染色體基因gelE編碼，能夠水解明膠、膠原蛋白和酪蛋白的細胞外鋅金屬蛋白酶。GelE和絲氨酸蛋白酶（SprE）由操縱子gelE-sprE編碼，其表達由fsr基因座編碼的群體感應系統(tǒng)（quorum sensing system）正向調(diào)控。fsr基因座由4個基因fsrABDC組成，最初被鑒定為金黃色葡萄球菌Agr群體感應系統(tǒng)的同源物[21]。fsr群體感應系統(tǒng)由明膠酶生物合成激活信息素（gelatinase biosynthesis activates pheromones，GBAP）調(diào)控，并且與兔眼內(nèi)炎和心內(nèi)膜炎模型中的毒力以及體外生物被膜形成相關(guān)[22]。據(jù)推測，F(xiàn)srB具有半胱氨酸蛋白酶活性，使其能夠?qū)srD編碼的GBAP前肽處理成活性GBAP[22]。GBAP前體FsrD在FsrB分泌過程中被加工成循環(huán)肽。成熟的GBAP與周圍細胞表面的FsrC傳感器激酶相互作用，導致DNA結(jié)合應答調(diào)節(jié)劑FsrA的磷酸化。磷酸化的FsrA結(jié)合啟動子，包括fsrB和gelE / sprE，并上調(diào)基因表達。研究表明gelE、sprE與生物被膜形成以及腸球菌毒力有關(guān)，具體機制仍需進一步

研究 [12， 23]。

聚集物質(zhì)是由質(zhì)粒asa1基因編碼的一種信息素誘導蛋白，其通過在供體和受體細菌之間形成交配聚集體來促進信息素質(zhì)粒的共軛轉(zhuǎn)移。作為毒力因子，聚集物質(zhì)促進細菌對腎小管細胞和心臟心內(nèi)膜細胞的黏附，增強腸上皮細胞的內(nèi)化，并已顯示能夠增加動物心內(nèi)膜炎模型中瓣膜贅生物的質(zhì)量。

溶細胞素由2種成分組成，即溶細胞素（L）和活化劑（A）。 溶細胞素操縱子由5個基因組成，其中cylL1、cylL2、cylM和cylB與組分L的表達相關(guān)，而cylA是組分A表達所必需的。溶細胞素的產(chǎn)生可在動物模型中導致心內(nèi)膜炎和眼內(nèi)炎惡化，亦可引起人類腸球菌病[24]。

2.2 eDNNAA

eDNA由許多細胞在自溶過程中釋放，并作為黏合劑，對生物被膜的附著及穩(wěn)定起到了很重要的作用[25]。在糞腸球菌中，eDNA主要來源于在群體感應系統(tǒng)調(diào)控下的細胞亞群體溶解（自溶），這個過程被稱為自殺，由細胞壁水解酶或自溶素（Atl）介導[26]。研究發(fā)現(xiàn)，兩種分泌和共調(diào)節(jié)蛋白酶（GelE和SprE）是糞腸球菌生物被膜形成的關(guān)鍵組分，其相互作用調(diào)節(jié)了自溶和高分子量eDNA的釋放[26]。隨后，研究者通過生物信息學方法篩選和鑒定了屎腸球菌E1162的主要自溶素，首次發(fā)現(xiàn)基因EfmE1161-2692是屎腸球菌中主要的自溶素，并被重新命名為atlAEfm，對屎腸球菌生物被膜中eDNA的釋放至關(guān)重要。atlAEfm的破壞可導致抗溶解，eDNA減少，從而細菌附著不足，生物被膜減少[27]。多數(shù)研究證明eDNA是生物被膜形成的前提條件[28]。

2.3 心內(nèi)膜炎和生物被膜相關(guān)菌毛（endocardittiiss--and biofilm-associated pilus，Ebp）

在糞腸球菌中，已有學者研究證明Ebp對腸球菌生物被膜的形成有關(guān) ，并能引起多種疾病[29]。在許多心內(nèi)膜炎患者中發(fā)現(xiàn)了高滴度的針對糞腸球菌Ebp的抗體，表明EbpA、EbpB、EbpC和分選酶StrC可在生物被膜形成中發(fā)揮作用。

Ebp屬于分選酶組裝的菌毛家族的成員，是一種由三個亞基組成的聚合物：主要亞基（EbpC）以及次要亞基纖維基部（EbpB）和尖端（EbpA）。Flores-Mireles等[30]通過小鼠模型比較缺失突變株及野生株生物被膜形成情況，發(fā)現(xiàn)EbpA中的MIDAS序列是糞腸球菌生物被膜形成的必要條件。同時，在研究過程中發(fā)現(xiàn)含EbpA的野生株在體外實驗中不能形成生物被膜，從而發(fā)現(xiàn)當機體發(fā)生尿路感染后，機體發(fā)生炎性反應，宿主釋放纖維蛋白原至膀胱，EbpA的N-末端結(jié)構(gòu)域介導了與纖維蛋白原的結(jié)合，而后形成生物被膜。然而在體外，體系中沒有纖維蛋白原，生物被膜無法形成[30]。這也提示我們阻斷EbpA與纖維蛋白原的結(jié)合也許可以阻止糞腸球菌生物被膜的形成。

目前對腸球菌生物被膜的形成機制研究尚不清楚，但可以看出生物被膜的形成過程是一個復雜的多基因多因素調(diào)控過程，并非某個基因或蛋白決定[24]。

3 臨床意義

3.1 生物材料植入物感染

目前生物被膜感染依然是生物材料植入物失敗的主要原因。細菌定植在生物材料上（假體、人工心瓣膜、導尿管、中心靜脈導管等）形成生物被膜，生物被膜外層物質(zhì)阻止抗菌藥物滲入細胞膜內(nèi)，久而久之形成慢性感染。導尿管相關(guān)性尿路感染是醫(yī)院獲得性感染最常見的類型，從無菌尿液轉(zhuǎn)化為菌尿的發(fā)生率從每天3%提高到10%[5，31]。此外，所有長期留置導尿管患者中，3%在30 d內(nèi)會發(fā)生菌血癥。幾乎所有患者在導管放置30 d后都會發(fā)生感染[5]。耐藥性已成為導尿管相關(guān)性尿路感染治療的一個關(guān)鍵問題，尤其是由腸球菌屬引起的感染，占所有導尿管相關(guān)性尿路感染的15%[32]。

3.2 感染性心內(nèi)膜炎

感染性心內(nèi)膜炎具有較高發(fā)病率和病死率。近年來歐美學者發(fā)現(xiàn)腸球菌感染性心內(nèi)膜炎比例在不斷升高。糞腸球菌是引起感染性心內(nèi)膜炎的重要病原菌，病死率高達20%。目前研究發(fā)現(xiàn)感染性心內(nèi)膜炎糞腸球菌分離株形成生物被膜能力強于非感染性心內(nèi)膜炎菌株[33]。由于生物被膜在體內(nèi)難以清除，給臨床治療帶來了很大的挑戰(zhàn)。

在某些情況下，持續(xù)高劑量的抗菌藥物治療也無法消除感染，只能選擇拔除導管或取出植入物。因此，與生物材料有關(guān)的感染需要緊急預防。目前群體感應系統(tǒng)猝滅劑、聚合物涂層、抗菌涂層、酶介導的方法、噬菌體療法、免疫療法、納米結(jié)構(gòu)涂層、表面修飾和生物表面活性劑等各種新型緊急策略可以控制醫(yī)用植入物中生物被膜的形成[34-35]。

3.2 生物被膜耐藥性增加

研究表明成熟的生物被膜能夠耐受比殺死浮游細菌所需濃度高10～1 000倍的抗生素[36-37]。目前所知，微生物生物被膜主要以兩種方式抵抗抗生素治療：抗生素抗性的遺傳編碼機制和賦予藥物耐受性的可逆表型?？股乜剐允俏⑸锏挚箍咕鷦┳饔玫墨@得性能力，與遺傳有關(guān)。與抗生素抗性相反，抗生素耐受性不是由抗性基因的突變或遺傳引起的，它是由生物被膜細胞群的生理狀態(tài)定義的暫時的、不可遺傳的表型，抗生素耐受性還可以通過限制藥物擴散和活性的生物被膜特異性特征介導。

生物被膜相關(guān)的耐藥性和耐受性在許多亞急性和慢性細菌感染的發(fā)病機制中起主要作用，且抗生素治療困難，如肺囊性纖維化相關(guān)感染、心內(nèi)膜炎、慢性傷口感染[37]。

4 結(jié)語

生物被膜自發(fā)現(xiàn)以來一直備受研究者關(guān)注，形成機制錯綜復雜，生物被膜的耐藥性及耐受性比浮游生物更加嚴重。細菌種類不同，生物被膜的形成機制以及調(diào)控系統(tǒng)也有差異，因此給治療也帶來了很大的挑戰(zhàn)。目前大部分治療方法主要針對浮游菌或敏感的腸球菌感染。因此，深入了解生物被膜形成的調(diào)控機制，可針對生物被膜形成的不同環(huán)節(jié)的機制研究新方法來特異性治療腸球菌生物被膜感染。