艱難梭菌芽孢抑制劑的研究進(jìn)展

翟 宇， 強(qiáng)翠欣， 趙建宏

作者單位： 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北省臨床檢驗(yàn)中心，石家莊 050000。

艱難梭菌（Clostridioides difficile）是一種專性厭氧、革蘭陽性桿菌，是重要的醫(yī)院感染致病菌。艱難梭菌可以產(chǎn)生毒素，形成芽孢，可引發(fā)感染，臨床表現(xiàn)可從輕度腹瀉至偽膜性結(jié)腸炎甚至死亡，病死率可達(dá)3%～15%[1]。艱難梭菌芽孢能夠抵抗不利的物理、化學(xué)和代謝條件[2]，對艱難梭菌存活、傳播起重要作用。艱難梭菌感染高復(fù)發(fā)率的原因可能是因?yàn)槠D難梭菌以芽孢形式存在于患者的腸道后萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞（vegetative cell）所致[3]。目前，艱難梭菌感染的治療藥物主要是萬古霉素、甲硝唑或非達(dá)霉素等[4]。雖然抗生素初治有效，但是艱難梭菌感染患者初愈后復(fù)發(fā)率高達(dá)12%～40%[1]，并且首次復(fù)發(fā)后，再次復(fù)發(fā)率上升至64%[5]。所以抑制艱難梭菌芽孢的萌發(fā)和生長，對于控制艱難梭菌感染、傳播和復(fù)發(fā)非常重要。

1 消毒劑

1.1 過氧化氫

過氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，水溶液俗稱雙氧水，主要通過氧化細(xì)胞壁來殺滅細(xì)菌[6]。過氧化氫可以在病房使用，起到加強(qiáng)清潔和消毒的作用。Kenters等[7]對4種當(dāng)?shù)爻Ｓ玫南緞┻M(jìn)行比較，通過計(jì)算菌落形成單位（colony forming unit，CFU）來測定艱難梭菌芽孢殺滅情況，結(jié)果表明含過氧化氫的消毒劑效果最好，對艱難梭菌RT010、027、014型芽孢均有抑制作用，采用過氧化氫濕巾擦拭方法減少量為5.29（95%CI5.04～5.54）log10CFU，而采用過氧化氫噴霧方法減少4.08（95%CI3.83～4.33）log10CFU，擦拭法對于艱難梭菌芽孢殺滅效果更好（P＜0.001）。

1.2 含氯消毒劑

用含氯消毒劑對醫(yī)院環(huán)境表面進(jìn)行消毒是控制艱難梭菌傳播的主要措施[8]，含氯消毒劑主要對微生物的DNA或蛋白質(zhì)等造成氧化損傷。含氯消毒劑抑制艱難梭菌芽孢的形成，因此可以降低艱難梭菌感染的罹患率。Goda等[9]將弱酸性氯化亞酸水（weakly acidified chlorous acid water，WACAW）和次氯酸鈉（NaClO）溶液對殺滅艱難梭菌芽孢的效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示游離氯濃度為50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的WACAW均可在1 min內(nèi)殺滅艱難梭菌芽孢數(shù)超過3.5 log10CFU，而只有當(dāng)NaClO溶液的游離氯濃度達(dá)到200 mg/L時才能達(dá)到同樣的殺滅效果。因含氯消毒劑主要活性成分游離氯的氧化能力可以被有機(jī)物中和，有機(jī)物的存在會使NaClO的殺菌活性普遍降低，但是WACAW可經(jīng)硫代硫酸鈉部分中和后恢復(fù)到初始水平，使之在有機(jī)物質(zhì)富集環(huán)境下相對穩(wěn)定，因此可能有助于處理被人類排泄物污染的環(huán)境表面。

1.3 酸化乙醇

接觸過艱難梭菌感染患者的醫(yī)護(hù)人員手套和衣服上有感染艱難梭菌芽孢的風(fēng)險。Landelle等[10]發(fā)現(xiàn)24%接觸過艱難梭菌感染患者的醫(yī)護(hù)人員在摘手套后手上會有艱難梭菌芽孢殘留。含乙醇的洗手液對去除艱難梭菌芽孢無效，而用肥皂洗手去除艱難梭菌芽孢只是中等效果[11]。Tomas等[12]發(fā)現(xiàn)酸化乙醇，即用鹽酸調(diào)整pH為1.3的70%乙醇，能有效地快速清除醫(yī)護(hù)人員手套上的艱難梭菌芽孢，并且不會腐蝕衣物或引起呼吸道刺激。實(shí)驗(yàn)將酸化乙醇與1∶10和1∶100稀釋的家用漂白劑（主要成分為NaClO）以及沒有調(diào)整pH值的70%乙醇進(jìn)行比較，結(jié)果顯示酸化乙醇的滅菌效果相當(dāng)于1∶100稀釋的家用漂白劑，消毒前后手套上艱難梭菌數(shù)量減少差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），70%乙醇沒有抑制艱難梭菌芽孢的作用。但由于酸化乙醇對衣物沒有漂白作用，也沒有不良?xì)馕洞碳ず粑馈Ｋ运峄掖急绕讋┖?0%乙醇更適合于清除醫(yī)護(hù)人員手套上的艱難梭菌芽孢殘 留。

1.4 氯己定

氯己定又名洗必泰，是一種陽離子表面活性劑，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、酵母和包膜病毒有抗菌活性[13]，被廣泛應(yīng)用于各種消毒劑和防腐劑中。氯己定是一種膜活性化合物，通過與細(xì)胞壁和質(zhì)膜相關(guān)的負(fù)電荷相互作用，破壞營養(yǎng)細(xì)胞的保護(hù)性屏障。氯己定的抗菌活性對完整的休眠芽孢無效[14]，但是通過物理或化學(xué)方法來穿透或降解芽孢保護(hù)層，使氯己定進(jìn)入芽孢后就可以發(fā)揮其抗菌活性。Nerandzic等[15]實(shí)驗(yàn)證明，加熱、加入乙醇和升高pH均可提高氯己定對艱難梭菌芽孢的殺滅效果。艱難梭菌芽孢在80℃氯己定中暴露15 min后，實(shí)驗(yàn)觀察到芽孢完全消除；加入70%乙醇的氯己定可在37℃時將艱難梭菌減少約1 log10CFU的時間從3 h縮短到1 h；將氯己定的pH從4提高到＞9.5，顯著提高了氯己定對艱難梭菌芽孢的殺滅作用（P＜0.001）。這些數(shù)據(jù)表明，改變物理或化學(xué)條件可以提高氯己定對艱難梭菌芽孢的殺菌活性。

2 抗菌藥物

2.1 非達(dá)霉素

非達(dá)霉素是2011年批準(zhǔn)上市的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，臨床Ⅲ期試驗(yàn)證明非達(dá)霉素在治療艱難梭菌感染后25 d沒有復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率低于萬古霉素[16]。有研究證明非達(dá)霉素與其主要代謝產(chǎn)物OP-1118能抑制艱難梭菌芽孢形成[16-17]。Babakhani等[17]將亞抑菌濃度的非達(dá)霉素加入早期穩(wěn)定期的菌液中，之后每隔一段時間定量計(jì)算菌液中的總菌數(shù)和耐熱芽孢數(shù)，結(jié)果表明1/4 MIC的非達(dá)霉素及其主要代謝產(chǎn)物OP-1118即能抑制艱難梭菌芽孢形成，而相似亞抑菌濃度的萬古霉素、甲硝唑和利福平均不能抑制艱難梭菌芽孢形成。除抑制芽孢形成外，抑制艱難梭菌芽孢轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)細(xì)胞，也是防止艱難梭菌感染復(fù)發(fā)的有效途徑。Allen等[18]研究表明雖然非達(dá)霉素并不會影響艱難梭菌芽孢的萌發(fā)，但可以抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)后營養(yǎng)細(xì)胞的生長從而減少艱難梭菌感染的復(fù)發(fā)和傳播[19]。

2.2 奧利萬星

奧利萬星是一種新型的半合成脂糖肽，具有良好的抗菌活性[20]。有報道稱，奧利萬星在體外腸道模型中對模擬艱難梭菌感染的治療非常有效，并且沒有誘導(dǎo)艱難梭菌感染的傾向[21-22]。雖然奧利萬星對艱難梭菌芽孢萌發(fā)沒有作用，但是可以減慢芽孢生長速度。Chilton等[23]用相差顯微鏡觀察4株艱難梭菌（分別為核糖體027、001、106、078型）在不同抗生素作用下折光性強(qiáng)、相對明亮（phase-bright）的芽孢，折光性弱、相對較暗（phase-dark）的芽孢和營養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量變化，結(jié)果表明，暴露于萬古霉素、甲硝唑和奧利萬星的芽孢從相對明亮轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬^暗的速率與空白對照組相同， 24 h后萬古霉素和甲硝唑處理的芽孢從相對較暗生長為營養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量與空白對照組相當(dāng)，80%芽孢生長為營養(yǎng)細(xì)胞；而奧利萬星處理的芽孢僅有20%從相對較暗生長為營養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果表明奧利萬星在亞抑菌濃度水平可以抑制芽孢由相對較暗向營養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，但不能抑制艱難梭菌芽孢由相對明亮轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬^暗。

2.3 雷莫拉寧

雷莫拉寧是一種糖肽類抗生素，其作用機(jī)制是阻止細(xì)胞壁肽聚糖生物合成，對需氧和厭氧革蘭陽性菌包括對萬古霉素耐藥的腸球菌都有抗菌活性。Kraus等[24]通過體外模型實(shí)驗(yàn)表明雷莫拉寧可以結(jié)合艱難梭菌芽孢，并且可以高效率地殺死艱難梭菌營養(yǎng)細(xì)胞。Freeman等[25]通過動物實(shí)驗(yàn)證明雷莫拉寧在減少艱難梭菌芽孢形成和釋放方面優(yōu)于萬古霉素，雷莫拉寧治療組盲腸內(nèi)容物內(nèi)仍有艱難梭菌芽孢的小鼠數(shù)量（6/23）比用萬古霉素治療組（19/23）少（P＜0.05）。

2.4 卡達(dá)唑胺

2.5 Ridinilazole

Ridinilazole前身為SMT19969，是一種新型的窄譜合成抗菌藥物。這一類新型雜環(huán)類抗菌藥物的作用機(jī)制尚未完全闡明，但目前已知ridinilazole可抑制細(xì)菌DNA合成[31-32]。此外，Bassères等[33]研究表明，與其他傳統(tǒng)的抗生素相比，ridinilazole可誘導(dǎo)艱難梭菌菌體延長、抑制分裂及芽孢形成。

2.6 Surotomycin

Surotomycin以前稱為CB-183315，是一種窄譜環(huán)脂肽類抗生素，適應(yīng)證為艱難梭菌相關(guān)性腹瀉[34]。Aldape等[35]用surotomycin對3株艱難梭菌毒素產(chǎn)生和芽孢形成情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明低濃度surotomycin [約（1～2）×10-3mg/L]可以抑制艱難梭菌毒素產(chǎn)生，同時劑量依賴性地減少了3株艱難梭菌芽孢的形成，這些結(jié)果有利于surotomycin用于艱難梭菌感染治療的新藥開發(fā)。

2.7 CRS3123

CRS3123前身為REP3123，是一種最近開發(fā)的全合成二芳基二胺抗菌藥物[36]，通過抑制細(xì)菌蛋白合成來抑制艱難梭菌生長和芽孢產(chǎn)生[37]。Ochsner等[38]在固體培養(yǎng)基上比較REP3123、萬古霉素和甲硝唑?qū)ζD難梭菌芽孢形成的作用。亞抑菌濃度下不同抗菌藥物處理后，艱難梭菌芽孢形成有不同變化。1/2 MIC和1/4 MIC濃度REP3123處理后所有菌株芽孢產(chǎn)量均有所下降；3株艱難梭菌在亞抑菌濃度甲硝唑處理后，芽孢產(chǎn)量顯著增加；2株艱難梭菌在亞抑菌濃度萬古霉素處理后，芽孢產(chǎn)量顯著增加。

3 益生菌與益生元

腸道菌群的不同代謝產(chǎn)物可干擾艱難梭菌感染的發(fā)病，阻止艱難梭菌芽孢的萌發(fā)。對于艱難梭菌感染特別是復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染，替代療法建議以糞便移植的形式應(yīng)用腸道益生菌，以糾正腸道菌群失調(diào)[39]。R?tsep等[40]實(shí)驗(yàn)證明艱難梭菌的存在不影響植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的生長，但植物乳桿菌可以影響艱難梭菌的生長。將艱難梭菌與植物乳桿菌共同培養(yǎng)24 h后，15株艱難梭菌中有13株計(jì)數(shù)降至0；同時，在植物乳桿菌預(yù)孵育的BHI培養(yǎng)基中，艱難梭菌芽孢萌發(fā)延遲24 h，但在植物乳桿菌和木糖醇共同預(yù)孵育的BHI培養(yǎng)基中，48 h內(nèi)完全抑制了艱難梭菌芽孢的萌發(fā)。木糖醇和植物乳桿菌共同作用可抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)和營養(yǎng)細(xì)胞形成，減少艱難梭菌在腸道內(nèi)定植，為日后預(yù)防艱難梭菌感染及防止復(fù)發(fā)提供新的思路。

4 膽汁酸

4.1 次級膽汁酸

人體肝臟中的初級膽汁酸進(jìn)入腸道在細(xì)菌的作用下與?；撬峄蚋拾彼峤Y(jié)合形成次級膽汁酸[41]。?；悄懰幔═CA）可以刺激艱難梭菌芽孢萌發(fā)，而鵝脫氧膽酸（CDCA）是TCA介導(dǎo)的艱難梭菌芽孢萌發(fā)過程的拮抗劑，0.04% CDCA即可抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)[42]。人體腸道內(nèi)大約有50種次級膽汁酸，小鼠體內(nèi)有2種人體中不存在的膽汁酸，即α-鼠膽酸（AMA）和β-鼠膽酸（BMA）。ω- 鼠膽酸（OMA） 是由正常菌群產(chǎn)生的BMA異構(gòu)體。Thanissery等[43]對常見的次級膽汁酸，如脫氧膽酸（DCA）、石膽酸（LCA）、熊脫氧膽酸（UDCA）、脫氧膽酸羥化物（iDCA）、石膽酸羥化物（iLCA）、OMA和豬脫氧膽酸（HDCA）在艱難梭菌芽孢萌發(fā)、生長和毒素產(chǎn)生方面進(jìn)行體外試驗(yàn)。結(jié)果顯示0.2% DCA和0.1% iLCA即可有效抑制實(shí)驗(yàn)所用的7株不同型別的艱難梭菌芽孢萌發(fā)，其他5種次級膽汁酸至少抑制了5株艱難梭菌芽孢萌發(fā)。Francis等[44]針對不同濃度鼠膽酸對艱難梭菌芽孢萌發(fā)影響情況進(jìn)行比較，結(jié)果表明3種鼠膽酸均能在體外抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)，并且BMA比AMA更有效。由于次級膽汁酸可以改變艱難梭菌的生長周期，這意味著未來次級膽汁酸可以成為潛在的艱難梭菌感染治療方法，但目前還需要在機(jī)制方面深入研究。

4.2 膽汁酸衍生物

人體中CDCA抑制艱難梭菌芽孢的萌發(fā)，但是抗生素會使膽汁酸代謝紊亂而影響CDCA的釋放；另一種抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)的內(nèi)源性膽汁酸UDCA，由于必須從回腸重吸收到腸肝循環(huán)中，不能在結(jié)腸內(nèi)達(dá)到抑制艱難梭菌芽孢所需的濃度。Stoltz等[45]對CDCA和UDCA進(jìn)行化學(xué)修飾，用核糖體027型艱難梭菌對合成的化合物進(jìn)行篩選，結(jié)果表明UDCA的C24酰胺或四唑衍生物是最有效的化合物，此外C3的取代物耐受良好，而C7的取代物通常會降低化合物的抑制活性。Howerton等[46]發(fā)現(xiàn)一種膽酸甲苯磺酸衍生物CamSA能夠抑制艱難梭菌芽孢在小鼠體內(nèi)萌發(fā)。研究者用大量的艱難梭菌芽孢感染小鼠，之后給予小鼠不同濃度的CamSA并監(jiān)測癥狀，同時對糞便中艱難梭菌芽孢和營養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有觀察到藥物毒性的情況下，50 mg/ kg CamSA可以避免感染艱難梭菌芽孢的小鼠發(fā)展為艱難梭菌感染，但是無法避免感染艱難梭菌營養(yǎng)細(xì)胞的小鼠發(fā)展為艱難梭菌感染。較低劑量的CamSA可延緩艱難梭菌感染發(fā)作并減輕癥狀。CamSA可以通過抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)為營養(yǎng)細(xì)胞，從而抑制艱難梭菌感 染。

5 天然產(chǎn)物及其提取物

5.1 香芹酚

香芹酚是一種單萜類苯酚，來源于植物的食品級化合物，有抗菌和抗炎的功效。體外試驗(yàn)表明，香芹酚能有效地抑制艱難梭菌產(chǎn)生毒素，而不影響人類正常胃腸道菌群[47]。Mooyottu等[48]繼續(xù)就香芹酚對艱難梭菌芽孢產(chǎn)生、萌發(fā)和生長等方面進(jìn)行試驗(yàn)。研究者將亞抑菌濃度的香芹酚加入到含艱難梭菌的肉湯中，之后對艱難梭菌營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示香芹酚對艱難梭菌營養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量沒有影響，48 h、72 h、96 h的艱難梭菌芽孢產(chǎn)生量比對照組顯著減少，證明香芹酚可以抑制艱難梭菌芽孢產(chǎn)生；同時對艱難梭菌芽孢萌發(fā)生長曲線進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果顯示亞抑菌濃度的香芹酚可以減少艱難梭菌芽孢生長成營養(yǎng)細(xì)胞，而最低抑菌濃度的香芹酚可以完全抑制艱難梭菌芽孢生長成營養(yǎng)細(xì)胞；同時研究者發(fā)現(xiàn)香芹酚顯著下調(diào)了艱難梭菌芽孢相關(guān)基因表達(dá)，如spo0A、spo IIR、spoIIID、sigH和CD2492。

5.2 Rhodomyrtone

Rhodomyrtone是一種來自玫瑰桃金娘草葉子的天然小分子物質(zhì)，對革蘭陽性菌具有強(qiáng)大的殺菌活性，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和產(chǎn)芽孢的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌[49]。Srisuwan等[50]對比了rhodomyrtone和萬古霉素對艱難梭菌芽孢生長的作用。結(jié)果表明rhodomyrtone和萬古霉素抑制艱難梭菌芽孢生長的濃度分別為0.625 mg/L和2.5 mg/L。Rhodomyrtone對艱難梭菌芽孢生長為營養(yǎng)細(xì)胞的抑制作用是萬古霉素的4倍。

6 納米材料

如今，納米材料在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越多，一些有顯著抗微生物活性納米材料如銀、氧化鋅和氧化鈦納米顆粒已被用作替代殺菌劑?？咕鷻C(jī)制可能與產(chǎn)生活性氧、破壞細(xì)胞膜、結(jié)合硫醇基團(tuán)以及釋放有毒離子等有關(guān)[51]。含鐵顆粒通常被認(rèn)為是具有高度生物相容性的納米材料。最近報道一些特定的氧化鐵納米顆粒具有抗菌活性[52]。Lee等[53]評估Fe3-δO4納米顆粒能否抑制體內(nèi)艱難梭菌芽孢萌發(fā)。將艱難梭菌芽孢在0.5 μg/L Fe3-δO4中處理20 min，有64%不能萌發(fā)為營養(yǎng)細(xì)胞。Fe3-δO4通過與芽孢表面蛋白結(jié)合，減少芽孢釋放吡啶二羧酸（DPA）從而抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)。在艱難梭菌感染動物模型中，用Fe3-δO4處理過的艱難梭菌芽孢感染小鼠，小鼠結(jié)腸炎發(fā)病率下降為原來的1/3，并且Fe3-δO4對小鼠腸道菌群沒有影響。

隨著艱難梭菌感染發(fā)病率的增加和高產(chǎn)毒株027/NAP1/BI的暴發(fā)流行，艱難梭菌感染成為世界范圍內(nèi)不斷增長的公共健康問題[54]。艱難梭菌在醫(yī)院和療養(yǎng)院中的高度傳播與環(huán)境中具有大量高抵抗力的芽孢有關(guān)[55]。盡管毒素是導(dǎo)致艱難梭菌感染的主要致病因素，但艱難梭菌芽孢形成、萌發(fā)和生長為營養(yǎng)細(xì)胞是艱難梭菌感染傳播和復(fù)發(fā)的重要因素。復(fù)發(fā)是艱難梭菌感染的主要問題，有20%～30%患者有至少一次復(fù)發(fā)的經(jīng)歷[56]。所以，選用合理有效的消毒劑和藥物是阻止艱難梭菌芽孢傳播和抑制芽孢復(fù)發(fā)的重要措施。