比較Thermo STP6F藥敏測定卡與微量肉湯稀釋法測定鏈球菌對抗菌藥物的敏感性

趙婉彤， 潘 芬， 姚劍杰， 秦惠宏， 張 泓

肺炎鏈球菌在引起5歲以下兒童死于肺炎的致病菌中排名第一[1]。近年來隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性不斷增高，還相繼出現(xiàn)了多重耐藥菌株，給臨床抗感染治療帶來困難，藥敏試驗(yàn)在臨床治療中顯得愈發(fā)重要。目前臨床上常用的藥敏測定方法有紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法、E試驗(yàn)法和VITEK 2自動(dòng)化儀器法等。為臨床提供快速、準(zhǔn)確、方便的鏈球菌藥敏試驗(yàn)測定方法，本文以微量肉湯稀釋法為金標(biāo)準(zhǔn)（以下稱標(biāo)準(zhǔn)方法），比較賽默飛（Thermo）藥物敏感性試驗(yàn)STP6F苛養(yǎng)菌參考卡（以下簡稱Thermo STP6F藥敏卡）測定臨床分離鏈球菌對抗菌藥物的敏感性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如 下。

1 材料與方法

1.1 菌株

收集上海市兒童醫(yī)院臨床送檢標(biāo)本中的鏈球菌共199株進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)MS鑒定，其中肺炎鏈球菌123株、化膿鏈球菌40株、無乳鏈球菌36株。質(zhì)控菌株肺炎鏈球菌ATCC 49619，來自上海市臨床檢驗(yàn)中 心。

1.2 主要試劑與材料

細(xì)菌培養(yǎng)用血平皿為上海伊華生物有限公司產(chǎn)品，抗菌藥物粉劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（頭孢噻肟，N0929AS，92.20%；甲氧芐啶，A0709AS，99.80%；磺胺甲唑，M0505AS，99.90%）和中國食品藥品檢定研究院（青霉素，130437，93.10%；頭孢吡肟，130524-201404，84.50%；紅霉素，130307-201417，93.30%；克林霉素，130422-201306，84.90%；左氧氟沙星，130455-201607，97.30%；美羅培南，130506-201403，87.00%；四環(huán)素，130306-201419，969 μg/mg；萬古霉素，130360，1 066 μg/mg）。Thermo STP6F藥敏卡（B6062A）、接種培養(yǎng)基 [CP112-10]（920765）和自動(dòng)加樣機(jī)Sensititre?Autolnoculator?[V3010]由Thermo生物公司提供。

1.3 方法

將菌株復(fù)蘇后分區(qū)劃線接種于血平皿，培養(yǎng)后挑取典型單菌落傳代1次，置于35 ℃、5%CO2條件下再次培養(yǎng)20～24 h。采取直接菌落懸液法配制0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木簜溆谩?/p>

1.3.1 微量肉湯稀釋法 按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI ）M07-A9[2]的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，無菌操作將反復(fù)凍融的50%裂解的馬血（Laked horse blood，LHB）與雙倍陽離子調(diào)節(jié)肉湯（Caton-adjusted Mueller-Hnton Broth，CAMHB）混合，配成5% 凍融裂解馬血培養(yǎng)基，并在15 min內(nèi)完成藥敏試驗(yàn)。35 ℃空氣環(huán)境下培養(yǎng)20～24 h，根據(jù)CLSI M100-S26[3]提供的折點(diǎn)判讀其敏感性。

1.3.2 Thermo STP6F藥敏卡 按試劑盒說明書操作，將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌懸液接種至11 mL接種培養(yǎng)液中混勻后，根據(jù)Sensititre?Autolnoculator?[V3010]使用說明書對藥敏板進(jìn)行加樣，用黏性密封膜蓋上藥敏板所有微孔，孵育條件及結(jié)果判讀同微量肉湯稀釋法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

按ISO 20776-2指南計(jì)算以下指標(biāo)[4]，①基本一致率（essential agreement，EA）：兩種方法得到的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值完全一致或相差在±1個(gè)倍比稀釋度之內(nèi)；②分類一致率（categorical agreement，CA）：指按CLSI折點(diǎn)對兩種藥敏測試方法獲得的MIC值判讀敏感、中介或耐藥結(jié)果的一致性；③重大偏差（very major discrepancy，VMD）：標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的MIC值為“耐藥”（R）而測試方法獲得的MIC值為“敏感”（S）；④ 較大偏差（major discrepancy，MD）：標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的MIC值為S，而測試方法獲得的MIC值為R；⑤ 次要偏差（minor discrepancy，mD）：兩方法中任一個(gè)MIC值為“中介”（I），而另一MIC值為S或R。綜合比較所有菌株對測試獲得的所有MIC值的兩種方法結(jié)果計(jì)算得出總體CA和EA，總VMD、MD和mD以百分?jǐn)?shù)表達(dá)。當(dāng)EA＞90%、CA＞90%、VMD＜1.5%、MD＜3%、mD＜10%時(shí)則認(rèn)為測試方法藥敏結(jié)果可接 受。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法測試肺炎鏈球菌藥敏結(jié)果

Thermo STP6F藥敏卡板條測定10種抗菌藥物對74株青霉素敏感肺炎鏈球菌（PSSP）和49株青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PNSP）共123株肺炎鏈球菌的MIC值，與標(biāo)準(zhǔn)方法測試結(jié)果相比較，總體EA為95.5%，CA為94.6%，VMD、MD及mD分別為0.5%、1.2%和4.6%。除青霉素（以非腦膜炎折點(diǎn)計(jì)算）和美羅培南兩種測試方法獲得MIC值的CA分別為89.4%和81.3%外，其余抗菌藥物包括頭孢吡肟、頭孢噻肟、克林霉素、紅霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲唑和萬古霉素等MIC值的CA均大于90%（表1）。青霉素出現(xiàn)13株涉及中介結(jié)果mD（10.6%），未發(fā)生VMD和MD。美羅培南結(jié)果中有7株細(xì)菌的MIC值是差異±2個(gè)稀釋度，其中有3株Thermo STP6F藥敏卡將耐藥誤判為敏感（VMD，12.5%），1株將敏感誤判為耐藥（MD，2.0%）（圖1）。除美羅培南外，其余所檢測的抗菌藥物均未出現(xiàn)VMD。

表1 Thermo STP6F對123株肺炎鏈球菌測試結(jié)果與微量肉湯稀釋法比較Table 1 Susceptibility of 123 S. pneumoniae strains determined by Thermo STP6F plate and reference method broth microdilution

圖1 Thermo STP6F測試PSSP和PNSP對美羅培南敏感性結(jié)果與微量肉湯稀釋法比較Figure 1 Susceptibility testing results of meropenem against 123 strains of Streptococcus pneumoniae compared between broth microdilution （BMD） and Thermo STP6F plate

2.2 兩種方法測試化膿鏈球菌藥敏結(jié)果

對于化膿鏈球菌，兩種方法測得的抗菌藥物MIC值的總EA和CA分別為95.0%和99.2% ，VMD及MD皆為0.8%，mD為0。其中頭孢吡肟、頭孢噻肟、克林霉素、紅霉素、美羅培南、青霉素和萬古霉素等抗菌藥物MIC值的EA和CA 均為100%，左氧氟沙星、四環(huán)素的CA和EA分別為97.5%和85.0%、95.0%和75.0%（表2）。CLSI文件中的甲氧芐啶-磺胺甲唑無判讀折點(diǎn)，無法計(jì)算CA，其EA 90%。四環(huán)素和左氧氟沙星各有1株MIC結(jié)果被Thermo STP6F 錯(cuò)誤鑒定為耐藥（MD），另外四環(huán)素還有1株MIC結(jié)果被錯(cuò)誤鑒定為敏感（VMD）。

2.3 兩種方法測試無乳鏈球菌藥敏結(jié)果

對于無乳鏈球菌，兩者總體CA為97.8%，EA為93.6%，VMD為1.1%，MD為0.9%，mD為1.2%。其中頭孢吡肟、頭孢噻肟、美羅培南、青霉素、四環(huán)素和萬古霉素的CA均為100%?？肆置顾睾妥笱醴承堑腃A均大于90%，紅霉素的EA和CA均為88.9%（表3）。對于CLSI無適用耐藥折點(diǎn)的抗菌藥物，其CA按敏感或非敏感計(jì)算。

表2 Thermo STP6F 對40株化膿鏈球菌測試結(jié)果與微量肉湯稀釋法比較Table 2 Susceptibility of 40 S. pyogenes strains determined by Thermo STP6F plate and reference method broth microdilution

3 討論

國際上常采用CNAS-CL01等[5-6]提供的方法和標(biāo)準(zhǔn)評估AST新方法或設(shè)備。本文比較了Thermo STP6F藥敏卡和微量肉湯稀釋法兩種藥敏試驗(yàn)方法，測定10種抗菌藥物對臨床分離的199株鏈球菌的MIC值，結(jié)果顯示肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無乳鏈球菌的兩種測試方法獲得的結(jié)果EA和CA較好，但其中肺炎鏈球菌的青霉素和美羅培南CA低于90%，與國外報(bào)道的研究結(jié)果類似[7-8]。

表3 Thermo STP 6F 對36株無乳鏈球菌測試結(jié)果與微量肉湯稀釋法比較Table 3 Susceptibility of 36 S. agalactiae strains determined by Thermo STP6F plate and reference method broth microdilution

本組資料顯示Thermo STP6F藥敏卡測試頭孢噻肟、紅霉素、左氧氟沙星和青霉素的MIC值結(jié)果比金標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法高，與Rennie等[7]、Charles等[8]研究結(jié)果一致。VITEK 2因其方便快速等優(yōu)點(diǎn)在國內(nèi)微生物臨床實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用廣泛，但熊安英等[9]研究指出VITEK 2-Compact AST-GP68由于檢測原理局限使其對青霉素、美羅培南等藥敏試驗(yàn)結(jié)果易出現(xiàn)假耐藥現(xiàn)象。本組資料顯示Thermo STP6F 藥敏卡的青霉素結(jié)果常發(fā)現(xiàn)拖尾或跳孔現(xiàn)象，使終點(diǎn)難以確定，且MIC結(jié)果的判讀受人為主觀因素影響較大，一定程度上造成了MIC值的差異。故在實(shí)驗(yàn)操作中特別注意使菌懸液充分乳化，避免細(xì)菌懸浮分散不均勻。當(dāng)用肺炎鏈球菌測試氯霉素、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺和四環(huán)素時(shí)，判讀時(shí)在拖尾生長開始的最低濃度處讀取MIC，微弱生長的小點(diǎn)應(yīng)忽略不計(jì)，培養(yǎng)基中的甲氧芐啶和磺胺類抑制劑可以允許一些輕微的生長，與對照比較讀取終點(diǎn)濃度應(yīng)與生長對照相比抑制≥80%的生長。本組資料顯示雖然對于肺炎鏈球菌青霉素結(jié)果有近63.9%（23/36）的結(jié)果高出1個(gè)稀釋度，但其MD和VMD均為0。

74株P(guān)SSP和49株P(guān)NSP的美羅培南EA分別為98.6%和87.8%，123株肺炎鏈球菌美羅培南CA為81.3%。CA較低的主要原因是有19株細(xì)菌發(fā)生了mD，其中有15株細(xì)菌Thermo STP6F測定的MIC值低于標(biāo)準(zhǔn)方法測定MIC值1個(gè)稀釋度，故12株標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果判斷為中介、Thermo STP6F結(jié)果為敏感；3株標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為耐藥、Thermo STP6F結(jié)果為中介；此外，2株標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為中介、Thermo STP6F結(jié)果為耐藥，2株標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為敏感、Thermo STP6F結(jié)果為中介。但在化膿鏈球菌和無乳鏈球菌中，美羅培南的EA為100%，可能由于化膿鏈球菌和無乳鏈球菌美羅培南MIC值都很低，從而呈現(xiàn)出的EA和CA均較好。稀釋法易受菌懸液濃度、抗生素拮抗劑含量和鈣鎂離子含量等影響，Rennie等[7]指出肉湯法中使用的微量體積肉湯會(huì)降低發(fā)現(xiàn)生長緩慢耐藥亞群的可能性，但這一點(diǎn)還尚不完全清楚 。對于肺炎鏈球菌美羅培南還沒有可靠的紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，檢測其體外抗菌活性最好使用稀釋法確定。當(dāng)青霉素對于非腦膜炎分離株MIC≤0.06 mg/L（或苯唑西林抑菌圈直徑≥20 mm）時(shí)，可預(yù)報(bào)美羅培南為敏感，當(dāng)青霉素MIC＞0.06 mg/L時(shí)，對美羅培南中介或耐藥的結(jié)果用E試驗(yàn)法復(fù)核[10]。

本文根據(jù)ISO 20776-2文件[4]中的要求，MD基于標(biāo)準(zhǔn)方法測定得出的敏感菌株數(shù)計(jì)算，VMD基于標(biāo)準(zhǔn)方法確定為耐藥分離株數(shù)目計(jì)算，而國內(nèi)許多研究的偏差基于所有菌株總數(shù)計(jì)算[9，11-12]，得出的偏差值會(huì)明顯偏 低。

本組資料顯示受試的各組鏈球菌屬細(xì)菌對各種抗菌藥物的敏感性兩種方法的CA有差異。如青霉素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、美羅培南和萬古霉素等對化膿鏈球菌、無乳鏈球菌MIC值都相對較低，兩種方法的CA均達(dá)100%。但肺炎鏈球菌對青霉素等上述β內(nèi)酰胺類就不盡然，兩種方法測試肺炎鏈球菌對青霉素的敏感性，74株P(guān)SSP的CA為87.8%；49株P(guān)NSP的CA為91.8%；123株肺炎鏈球菌總的CA為89.4%；而123株肺炎鏈球菌對萬古霉素總的CA為100%。提示CA與細(xì)菌對抗菌藥物敏感和耐藥性有關(guān)。

基于以上研究結(jié)果提示，Thermo鏈球菌MIC藥敏板條結(jié)果與手工微量肉湯稀釋法一致性較好，操作簡便，假敏感和假耐藥的風(fēng)險(xiǎn)很低，但其抗菌藥物濃度梯度覆蓋面窄，部分藥物結(jié)果與微量肉湯稀釋法有差異，臨床微生物室可根據(jù)具體的目的和實(shí)驗(yàn)室條件選擇合適的檢驗(yàn)方法，互為完善，在用于檢測肺炎鏈球菌對美羅培南藥物敏感性必要時(shí)建議結(jié)合E試驗(yàn)法復(fù)核結(jié) 果。