熒光聚合酶鏈反應(yīng)熔解曲線法快速檢測結(jié)核分枝桿菌及異煙肼耐藥突變的臨床應(yīng)用價值

陽 央， 馮 智， 侯 歡， 李芳芹

結(jié)核病是危害人類健康的古老疾病，至今仍是全球十大死亡原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織2018年全球結(jié)核病控制報告，2017年中國新發(fā)結(jié)核病患者占世界的9%，平均感染人數(shù)63/100 000，位居全球第二，也是耐藥結(jié)核病發(fā)生最多的三大國家之一；耐多藥/利福平（RIF）耐藥結(jié)核病平均發(fā)生數(shù)5.2/100 000[1]，一例未治療的耐藥結(jié)核菌感染患者每年可以傳染10～15個人，耐藥結(jié)核病已成為全球結(jié)核病死灰復(fù)燃的重要原因，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生健康[2]。耐藥性出現(xiàn)和迅速蔓延的一個因素是缺乏快速診斷，因此，快速診斷耐藥結(jié)核病獲得菌株耐藥信息是控制結(jié)核病傳播和治療的關(guān)鍵。

異煙肼（INH）是結(jié)核病化療的基礎(chǔ)，是治療和預(yù)防最重要藥物，熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）熔解曲線法是根據(jù)結(jié)核分枝桿菌野生型序列和突變序列不同熔點溫度（Tm）而產(chǎn)生不同熔解曲線設(shè)計，其基本原理是在一定環(huán)境下，雙鏈DNA在其長度和序列一定時，Tm值也一定，是其固有性質(zhì)，當(dāng)發(fā)生點突變、插入或缺失，Tm值下降，下降的幅度與發(fā)生點突變的類型、插入或缺失的堿基數(shù)目以及突變位點的位置有關(guān)；利用熒光標(biāo)記的探針對耐藥突變的位點進行特異性擴增，然后做熔解曲線，通過與野生型菌株比較從而判斷是否發(fā)生突變。本研究意在探討此方法在臨床快速檢測結(jié)核分枝桿菌及其INH耐藥突變的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 標(biāo)本來源 痰液標(biāo)本來源于延安市傳染病醫(yī)院2018年4－12月住院的370例肺結(jié)核確診患 者。

1.1.2 儀器與試劑 MGIT320儀及配套試劑購于美國BD公司，Lab-Aid 824全自動核酸提取儀及SLSN-96實時熒光PCR儀購于上海宏石醫(yī)療科技公司，HC-2518R高速冷凍離心機購于安徽中科中佳公司，結(jié)核分枝桿菌DNA提取和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）檢測試劑及INH耐藥突變檢測試劑盒來自廈門致善生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測與突變評估 在P2+實驗室按照操作規(guī)程對痰液標(biāo)本應(yīng)用MGIT320進行液體培養(yǎng)及藥敏，采用磁珠法提取痰液中MTBC的DNA，實時熒光PCR儀進行MTBC及INH耐藥突變快速檢測。剔除培養(yǎng)法結(jié)核陽性和MTBC陽性，因含菌量低未進行表型藥敏與耐藥突變檢測或藥敏試驗失敗的菌株，以培養(yǎng)法藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，評估熔解曲線法耐藥突變檢測。

1.2.2 INH耐藥突變 INH耐藥突變根據(jù)靶序列的熔解變化檢測ahpC啟動區(qū)（-44～-30以及-15～3位點）、inhA94密碼子、inhA啟動區(qū)（-17～-8位點）、和KatG315密碼子是否突變。參照說明書判斷結(jié)果［四個通道任意一通道中樣品的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時（ΔTm≥2 ℃）判斷為突變型］。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計處理，SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩種方法差異性檢測采用McNemarχ2檢驗，采用Kappa檢驗分析兩種方法檢測結(jié)果一致性（Kappa≥0.8高度一致；0.6≤Kappa＜0.8 一致性較好；0.4≤Kappa＜0.6 一致性中等；Kappa＜0.4 一致性較差）。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌檢出比較

370例肺結(jié)核患者，培養(yǎng)法檢出MTBC 175株，陽性率47.3%，其中148株進行了培養(yǎng)法表型藥敏試驗；熔解曲線法檢出157株，陽性率42.4%，其中128株進行了分子學(xué)藥敏試驗。兩種方法檢測MTBC的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.073），一致性中等（Kappa=0.510），熔解曲線法檢測MTBC的靈敏度69.1%，特異度81.5%，見表1。

表1 熒光PCR熔解曲線法與MGIT320液體培養(yǎng)法檢測MTBC結(jié)果Table 1 Detection of Mycobacterium tuberculosis complex by fluorescence PCR melting curve analysis and MGIT320 mycobacterial liquid culture

2.2 INH耐藥結(jié)果比較

同時有藥敏結(jié)果的115株菌株進行比較，培養(yǎng)法20株耐藥，95株敏感；熔解曲線法25株耐藥，90株敏感，兩種方法檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.125），具有高度一致性（Kappa= 0.807），熔解曲線法INH耐藥突變檢測靈敏度95.0%，特異度93.7%，見表2。

表2 INH耐藥突變與MGIT320液體培養(yǎng)法藥敏結(jié)果Table 2 Correlation between isoniazid resistance mutation detected by melting curve method and MGIT320 mycobacterial liquid culture and susceptibility testing

2.3 INH典型突變

25株INH耐藥突變株中熔解曲線法檢出17株KatG基因突變，其中1株合并ahpC啟動區(qū)突變，1株KatG基因缺失；3株inhA基因突變，5株為雜合樣品，典型KatG315突變?nèi)劢馇€見圖1，典型inhA突變?nèi)劢馇€見圖 2。

3 討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多檢測結(jié)核桿菌的分子生物學(xué)方法在臨床得到了廣泛應(yīng)用，包括實時熒光定量PCR檢測DNA，線性探針技術(shù)，基因芯片，半巢式全自動熒光定量PCR（Xpert MTB/RIF）及熔解曲線法等，其中Xpert MTB/RIF為WHO推薦方法，但儀器及檢測價格昂貴，只能測定RIF耐藥情況。相比較，由我國自主研發(fā)的熒光PCR熔解曲線法試劑盒能同時對多種一線及二線抗結(jié)核藥物進行耐藥檢測[3]，能快速獲得較全面的耐藥信息。

圖1 KatG315突變?nèi)劢馇€Figure 1 The melting curve of KatG315 mutation

圖2 inhA突變?nèi)劢馇€Figure 2 The melting curve of inhA mutation

本研究中培養(yǎng)法與熔解曲線法檢出MTBC的結(jié)果無差異，熔解曲線法檢出MTBC的靈敏度69.1%，特異度81.5%，靈敏度低于新疆相關(guān)研究[4]。培養(yǎng)法檢出MTBC 54株陽性，而熔解曲線法MTBC檢測陰性，靈敏度低可能原因：①直接以痰標(biāo)本提取結(jié)核菌DNA，某些痰標(biāo)本不合格或含菌量低（痰含菌量＜200 CFU/ mL）達不到熔解曲線法檢測靈敏度下限，造成假陰性，而培養(yǎng)法通常每毫升痰含100條以上抗酸菌可得到陽性結(jié)果；②核酸提取時痰液液化不全，或消化后存在抑制物，如血痰標(biāo)本擴增可能受抑制，而內(nèi)標(biāo)可能對抑制物檢測還存在一定局限，導(dǎo)致假陰性；③試劑盒反復(fù)凍融。熔解曲線法MTBC檢出36株，而培養(yǎng)法陰性，可能主要原因是熔解曲線法既能檢測死菌也能檢測活菌，而液體培養(yǎng)只針對活菌，因此，熔解曲線法不能有效區(qū)分是否為活動性結(jié)核；另外，有研究表明，液體培養(yǎng)法前期用NaOH處理痰液時會殺死部分結(jié)核菌，特別是菌量少的標(biāo)本[5]，可能也是造成結(jié)果不一致的一個因素。

分枝桿菌最重要的耐藥機制是由于基因突變或外排泵的激活，而不是像其他細菌中常見的耐藥機制是由于獲得耐藥質(zhì)粒或轉(zhuǎn)位子，耐多藥結(jié)核分枝桿菌，即至少同時耐INH和RIF的菌株，早在1985年就開始增多，INH耐藥的主要機制是katG（S315T）及inhA基因的突變[6]。katG基因編碼過氧化氫酶-過氧化物酶激活I(lǐng)NH形成異煙酰陰離子或自由基，與NAD反應(yīng)生成INH-NAD復(fù)合物，INH-NAD復(fù)合物抑制細胞壁分枝菌酸合成有關(guān)的靶點inhA蛋白，導(dǎo)致分枝菌酸生物合成的破壞和細菌死亡[7]。katG基因突變或缺失導(dǎo)致INH活化受阻，inhA突變導(dǎo)致INH作用靶點改變，從而產(chǎn)生耐藥，快速檢測INH耐藥突變有助于早期發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病。

本研究中，培養(yǎng)法進行表型藥敏試驗檢測率84.6%（148/175），熔解曲線法進行分子學(xué)藥敏試驗檢測率81.5%（128/157），前者略高于后者，可能由于痰標(biāo)本含菌量少，造成熔解曲線法MTBC檢測出現(xiàn)假陰性，因此，多次送檢也十分重要；另外，部分熔解曲線法檢測MTBC陽性，但是閾值循環(huán)數(shù)（Ct）值在23以上，我們未進行突變檢測，有研究表明，Ct值一旦高于23，很難進行突變檢測[8]。同時有INH藥敏結(jié)果的菌株進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩種方法耐藥檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，熔解曲線法INH耐藥突變檢測的靈敏度95.0%、特異度93.7%，高于杜鵬等[9]、劉艷等[4]研究。表型藥敏試驗?zāi)退幎蛔儥z測陰性的可能原因：①試劑盒本身檢測存在局限，只針對ahpC啟動區(qū)、inhA94密碼子、inhA啟動區(qū)及katG315密碼子的突變，其他類型突變引起的耐藥無法檢測；②INH耐藥機制復(fù)雜，如藥物外排泵的改變，耐藥突變可能無法檢測；③可能存在異質(zhì)性耐藥[10]（指同一標(biāo)本中同時存在耐藥和敏感的菌株），因耐藥菌株所占比例較低（本試劑盒檢測突變下限為40%）或試劑盒本身缺陷，熔解曲線法檢測不到，INH異質(zhì)性耐藥MGIT DST可以檢出預(yù)期1%耐藥菌[11]，而熔解曲線法檢出INH異質(zhì)性耐藥通常突變比例下限20%～40%[3]，有研究說明異質(zhì)性耐藥可能是多重耐藥結(jié)核菌和廣泛耐藥結(jié)核菌產(chǎn)生的先兆[12-13]，最近報道的一種高敏感檢測異質(zhì)性耐藥的深度熔解法，能檢出1%突變菌株比例的INH異質(zhì)性耐藥[14]，可能彌補目前分子學(xué)方法異質(zhì)性耐藥檢測的困境；④液體培養(yǎng)法污染率較熔解曲線法的污染率高，因此，部分培養(yǎng)法藥敏結(jié)果存在假陽性的可能，同時目前耐藥突變試劑盒48人份/盒，如果每次檢測數(shù)量少，試劑盒反復(fù)凍融，可能導(dǎo)致檢測效能降低，造成假陰性。表型藥敏試驗敏感而突變檢測陽性的可能原因：①熔解曲線法只篩查核酸序列，部分不引起氨基酸改變的突變（沉默突變），會被判為突變型，而這種突變不會引起耐藥的生物學(xué)改變；②試劑盒從方法學(xué)上并不能區(qū)分具體突變位點，而某些突變位點可能并不引起耐藥；③可能與菌株的低濃度耐藥有關(guān)，導(dǎo)致藥敏結(jié)果敏感，而突變檢測陽性，特別是在部分inhA突變菌株中，inhA的突變與低濃度INH耐藥有關(guān)，本次3株inhA突變菌株中，1株藥敏結(jié)果敏感；④同時存在異質(zhì)性耐藥或提取DNA不純，導(dǎo)致熔解曲線出現(xiàn)各種雜合峰或復(fù)雜熔解曲線，而雜合峰或復(fù)雜熔解曲線等的耐藥突變判斷受儀器性能及人工判斷的影響。本次實驗中，5株雜合樣品儀器自動判斷為耐藥，而藥敏結(jié)果均顯示敏感，對于雜合樣品最好重復(fù)進行檢驗。因此，臨床在INH突變檢測耐藥，而培養(yǎng)藥敏敏感時，特別是抗結(jié)核治療了一段時間和復(fù)治患者，此時檢測到的耐藥突變可能由于死菌引起，沉默突變或是與導(dǎo)致低濃度耐INH的突變等有關(guān)，是否需要改變治療方案需要謹(jǐn)慎，最好根據(jù)臨床抗結(jié)核效果和患者情況等因素決定是否改變，因為一些低濃度耐藥的患者可能受益于高劑量INH的治療[15]。本次實驗不足在于，未對存在差異的菌株進一步測序，進行比較的菌株有限，我們將繼續(xù)跟蹤研究，以期更精準(zhǔn)詳盡的報告。綜上所述，臨床報告耐藥突變陰性時，并不一定代表菌株對抗菌藥物是敏感的，而報告耐藥突變時，臨床上抗結(jié)核治療可能也是有效的。

本次通過對痰液樣本直接檢測表明，雖然熒光PCR熔解曲線法試劑盒還存在一些局限，但不可否認(rèn)它在快速診斷結(jié)核病和INH耐藥突變檢測中具有重要價值，熔解曲線法對INH耐藥突變檢測表現(xiàn)出高靈敏度和特異度，相信未來隨著分子生物技術(shù)的進一步發(fā)展，試劑盒和儀器的優(yōu)化，快速、準(zhǔn)確的分子藥敏方法，必將開啟抗結(jié)核治療的精準(zhǔn)時代。