小檗堿對(duì)糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖影響研究＊

楊靜 羅岷 劉萍 方飛 劉昌權(quán)3△

（1.宜賓衛(wèi)生學(xué)校藥學(xué)教研室，四川 宜賓644000；2.宜賓衛(wèi)生學(xué)校生理教研室，四川 宜賓644000；3.宜賓衛(wèi)生學(xué)校內(nèi)科教研室，四川 宜賓644000）

糖尿病慢性血管病變一直是患者早死及致殘的首要原因，糖尿病患者心血管病的發(fā)生率也顯著高于非糖尿病人群。血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）的異常增殖遷移和表型改變是糖尿病慢性血管病變的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，而血管平滑肌的異常增殖可能與核因子－κB激活有關(guān)。小檗堿（Berberine）毛茛科植物黃連素根莖中所含的一種主要生物堿，可由黃連、黃柏或三顆針提取，也可人工合成一種抗菌性生物堿，療效較確切。近年來(lái)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有顯著的降血糖影響［2］，在血管平滑肌細(xì)胞增殖方面也能產(chǎn)生抑制作用［3］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)和建立糖尿病大鼠VSMC模型，觀察小檗堿對(duì)大鼠VSMC的增殖及NF－κB核轉(zhuǎn)移的影響，評(píng)價(jià)小檗堿體外抗糖尿病血管病變作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重200－240g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供（合格證號(hào)：川醫(yī)動(dòng)字2401115）。

1.1.2 樣品及試劑

小檗堿（陜西森弗生物技術(shù)公司，純度99%，黃色結(jié)晶粉末）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào) S0130）；RPMI1640（GIBCO公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清（天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司）；CCK－8（碧云天生物技術(shù)研究所）；免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；NF－κB激活－核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 儀器

倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司，CKX41型）；CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司，MCO－15AC型）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW－CJ－1F型）；離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠，LG10－3A型）；電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A1104N型）；超低溫冰箱（日本Sanyo公司，MDF－192型）；高壓消毒鍋（上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX－40BI型）；酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，DNM－9602型）；優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司，UPH－IV－10T型）；激光共聚焦掃描顯微鏡（德國(guó)LEICA公司，TCS SP5型）。日本京都血糖儀（日本愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社，GT－1640型）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型建立

大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，pH 4.5，0.1%枸櫞酸緩沖液新鮮配制）55mg·kg－1造糖尿病大鼠模型。72h后采用大鼠斷尾取血測(cè)血糖值，連續(xù)測(cè)3d。以血糖水平＞16.7mmol·L－1為糖尿病建模成功。

1.2.2 血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)

取建模成功大鼠正常喂飼1M后頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡2－3min，在無(wú)菌環(huán)境中迅速取出胸主動(dòng)脈，剝?nèi)パ芡饽ぃコ齼?nèi)膜，取中膜血管平滑肌，剪成1.5－2.0mm3大小的組織塊，平鋪于培養(yǎng)瓶，加入含血清的RPMI1640，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 血管平滑肌細(xì)胞的鑒定

（1）用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞。（2）SMA免疫組織化學(xué)染色：將細(xì)胞接種于置有小玻片的6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞成致密單層后取出玻片，PBS沖洗后用冷丙酮固定，二步法進(jìn)行SMA免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取生長(zhǎng)良好細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞為5×104·ml－1接種24孔板。24h后開(kāi)始計(jì)數(shù)細(xì)胞，以后每隔24h計(jì)數(shù)一次，每次取3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)計(jì)數(shù)7d，計(jì)算平均值。根據(jù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞數(shù)·ml－1）為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 小檗堿50%抑制率濃度測(cè)定

將96孔板分為空白（培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照（細(xì)胞＋培養(yǎng)基）、藥物 對(duì) 照 （藥 物 ＋ 培 養(yǎng) 基）和 60，30，15，7.5，3.75，1.875μmol·L－1小檗堿組（細(xì)胞＋培養(yǎng)基＋藥物），取生長(zhǎng)良好的糖尿病VSMC細(xì)胞，調(diào)濃度為1×105·L－1后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用CCK－8法測(cè)定相應(yīng)的吸光度（Absorbent，A）值，按公式（1－A實(shí)驗(yàn)÷A對(duì)照）×100%得出不同濃度對(duì)應(yīng)的抑制率，計(jì)算50%抑制率濃度（IC50）。

1.2.6 NF－κB核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)

調(diào)整VSMC細(xì)胞濃度為1×105·L－1接種于6孔板中（板中事先放蓋玻片），培養(yǎng)1d待細(xì)胞貼壁，加入60，30，15，7.5，3.75，1.875μmol·L－1小檗堿培養(yǎng)1d，按 NF－κB激活－核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。于波長(zhǎng)460nm處在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核、細(xì)胞漿顏色，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖尿病血管平滑肌的鑒定

倒置相差顯微鏡下單個(gè)平滑肌細(xì)胞呈梭形，扇形或三角形狀，有多個(gè)細(xì)胞突起，胞漿豐富，胞質(zhì)密度高，不透明，核卵圓形居中，有多個(gè)核仁。細(xì)胞生長(zhǎng)致密時(shí)平行排列成束，部分重疊，表現(xiàn)為旋渦狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。經(jīng)特異的平滑肌α－actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，胞漿著色，呈陽(yáng)性反應(yīng)，高倍鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)大量棕色、與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲，即平滑肌α肌動(dòng)蛋白絲，見(jiàn)圖2。

圖1 糖尿病血管平滑肌第五代照片（×100）

圖2 糖尿病血管平滑肌細(xì)胞的α－SM action鑒定

2.2 正常組與糖尿病組大鼠血管平滑肌生長(zhǎng)曲線比較

可見(jiàn)兩者細(xì)胞增長(zhǎng)程度與天數(shù)呈S型關(guān)系，但糖尿病組血管平滑肌生長(zhǎng)速度比正常組快（圖3）。

圖3 糖尿病大鼠與正常組VSMC生長(zhǎng)曲線比較

2.3 小檗堿50%抑制率濃度

小檗堿對(duì)糖尿病血管平滑肌細(xì)胞增殖抑制呈明顯的劑量相關(guān)性，其IC50值為6.001±0.853μmol·L－1。小檗堿對(duì)正常血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，其IC50值為18.229±0.434μmol·L－1同模型組比較有顯著差異性（P＜0.05）。

2.4 小檗堿對(duì)VSMCs中NF－κB核轉(zhuǎn)位的影響

正常組血管平滑肌細(xì)胞呈梭形，扇形或三角形狀，散在成簇生長(zhǎng)，胞質(zhì)中有中等強(qiáng)度紅色熒光著色，胞核為藍(lán)色熒光著色（圖4A），糖尿病組VSMCs胞質(zhì)中紅色著色稍減弱，胞核中紅色熒光著色強(qiáng)（圖4B），小檗堿組可見(jiàn)胞質(zhì)中的紅色較糖尿病組強(qiáng)，正常組弱，胞核中紅色著色較模型組弱，正常組強(qiáng)（圖4C）。

圖4 不同狀態(tài)下糖尿病大鼠VSMCs中NF－κB分布 （×200）

3 討論

糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)性較正常人高3－4倍，糖尿病大血管并發(fā)癥是造成糖尿病病人殘疾和死亡的主要原因之一，最常見(jiàn)的表現(xiàn)就是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，常累及大血管［4］。VSMC是動(dòng)脈壁的主要成分，在血管內(nèi)膜增生及血管重塑中起重要作用。糖尿病慢性血管病變的主要發(fā)病機(jī)制VSMC增殖并遷移入內(nèi)膜，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致纖維組織增生，最終形成斑塊或血拴［5］。

NF－κB是存在于細(xì)胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，參與了動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程。研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化的VSMC和巨噬細(xì)胞中都大量存在激活的NF－κB［6］。Ramana KV等的研究直接證明了NF－κB調(diào)節(jié)VSMC增殖的重要作用［7］。NF－κB激活參與糖尿病血管病變也得到了證實(shí)：糖尿病時(shí)，在某些刺激因素如AGEs、氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂及細(xì)胞因子等的作用下，NF－κB被激活后即發(fā)生核轉(zhuǎn)位，P65亞基由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，與特定基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的特異性反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)血管細(xì)胞粘附分子－1（VCAM－1）合成，促進(jìn)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［8］。

本研究觀察到體外培養(yǎng)糖尿病VSMC生長(zhǎng)速度明顯高于正常血管平滑肌，同時(shí)糖尿病大鼠VSMC出現(xiàn)NF－κB的核轉(zhuǎn)移，提示糖尿病 VSMC有異常增殖，NF－κB在糖尿病大鼠VSMC中出現(xiàn)激活，與文獻(xiàn)報(bào)告一致。采用小檗堿干預(yù)后，小檗堿各劑量組明顯抑制血管平滑肌的增殖，并抑制了NF－κB的核轉(zhuǎn)移，提示小檗堿能夠抑制糖尿病血管平滑肌的異常增殖，而此作用可能與抑制NF－κB的核轉(zhuǎn)移有關(guān)。至于與其他血管異常增殖因素有無(wú)關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

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