三黃瀉心湯對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子影響的研究＊

周曉玲 張海 孟憲麗 胡泊洋

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川 成都610075）

三黃瀉心湯為醫(yī)圣張仲景名方，記載于《金匱要略》，由大黃、黃連和黃芩三味藥組成，全方重在瀉火解毒，清熱燥濕，后世廣泛用于里熱火毒之證，為歷驗(yàn)不爽之名方［1］。在前期工作中，發(fā)現(xiàn)大黃－黃芩藥對(duì)在實(shí)驗(yàn)中顯示出最強(qiáng)的抗內(nèi)毒素活性，其作用甚至超過(guò)了全方，在此基礎(chǔ)上篩選出了瀉心湯有效組分，由黃芩總黃酮與大黃總游離蒽醌配比而成。黃芩總黃酮與大黃總游離蒽醌各配比有一定程度的抑制巨噬細(xì)胞分泌NO的作用，并且瀉心湯有效組分能明顯抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥物質(zhì)IL－1β、TNF－α、iNOS mRNA的表達(dá)［2］。但是，前期的實(shí)驗(yàn)主要是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)角度，采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，建立LPS刺激RAW264.7細(xì)胞的炎癥細(xì)胞模型，觀(guān)察三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子的影響，從而為三黃瀉心湯是否對(duì)LPS攻擊產(chǎn)生的膿毒癥具有保護(hù)作用以及能否用于臨床膿毒癥的治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

大黃游離蒽醌提取物，江蘇省淮安市瑞雷生化制品有限公司；黃芩總黃酮提取物，四川世坤植化有限公司；有效組分為大黃游離蒽醌與黃芩總黃酮按重量比3∶2配伍而成［3］。黃連、黃芩、大黃三味藥均為飲片，購(gòu)自北京同仁堂成都春熙路北口店，瀉心湯由大黃、黃連、黃芩按2∶1∶1的劑量比組成。

1.1.2 試劑

ELISA試劑盒，R＆D進(jìn)口分裝；LPS Sigma公司；噻唑藍(lán)（MTT），購(gòu)自Salarbio公司；二甲基亞砜（DMSO），成都市科龍化工試劑廠(chǎng)生產(chǎn)；細(xì)胞培養(yǎng)液，賽墨飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清，北京元亨金馬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.1.3 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)于上海中科院生物科學(xué)研究院。

1.1.4 儀器

細(xì)胞CO2孵箱（日本SANYO公司，型號(hào)：MCO－15AC）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)：IX70）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司，型號(hào)：SW－CJ－2F雙人雙面凈化工作臺(tái)）；細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)COSTAR公司）；酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）、100U·ml－1青霉素，100U·ml－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入含胰酶消化液1－2ml，消化約2－5min，棄消化液，加入新培養(yǎng)液吹打混懸細(xì)胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶，加入6.3ml DMEM＋0.7ml FBS，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，隔天換液一次。傳代三次以上，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7生長(zhǎng)活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將濃度為2×105·ml－1的細(xì)胞加入96孔板，每孔200μl，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合后，棄上清液。每孔加入100μl DMEM，再加100μl不同濃度的藥物干預(yù)培養(yǎng)或無(wú)血清DMEM。設(shè)置空白對(duì)照組、受試藥物組?？瞻讓?duì)照組培養(yǎng)液中加入等體積無(wú)血清DMEM，受試藥物組加入不同濃度的各受試藥物。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2中培養(yǎng)24h。細(xì)胞于培養(yǎng)結(jié)束，加入5mg·ml－1MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸出培養(yǎng)液，并加入150μl DMSO，490nm測(cè)定各組的OD值。

1.2.3 三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7釋放炎性細(xì)胞因子的影響

將濃度為2×105·ml－1的細(xì)胞加入24孔板，每孔l ml，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡貼壁24h。待細(xì)胞融合后，棄去上清液。重新加入DMEM培養(yǎng)液800μl。每孔加入不同濃度的三黃瀉心湯、三黃瀉心湯有效組分或無(wú)血清DMEM 100μl，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h后，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液100μl。24h后，取細(xì)胞上清液200μl，－20℃凍存。

實(shí)驗(yàn)分組及所加試劑：空白組：DMEM＋DMEM；A1組：瀉心湯250μg·ml－1；A2組：瀉心湯50μg·ml－1；A3組：瀉心湯10μg·ml－1；B1組：有效組分50μg·ml－1；B2組：有效組分10μg·ml－1；B3組：有效組分2μg·ml－1。

1.2.4 三黃瀉心湯對(duì)LPS刺激的RAW264.7釋放炎性細(xì)胞因子的影響

將濃度為2×105·ml－1的細(xì)胞加入24孔板，每孔l ml，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡貼壁24h。待細(xì)胞融合后，棄去上清液。重新加入DMEM培養(yǎng)液800μl。每孔加入1μmol·L－1煙堿、不同濃度的三黃瀉心湯和三黃瀉心湯有效組分或無(wú)血清DMEM 100μl，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h后，分別加入1μg·ml－1LPS或無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液100μl。24h后，取細(xì)胞上清液200μl，－20℃凍存。

實(shí)驗(yàn)分組及每組所加試劑如下：空白組：DMEM＋DMEM；模型組：DMEM＋LPS；A1組：瀉心湯250μg·ml－1＋ LPS；A2組：瀉心湯50μg·ml－1＋LPS；A3組：瀉心湯10μg·ml－1＋LPS；B1組：有效組分50μg·ml－1＋LPS；B2組：有效組分10μg·ml－1＋ LPS；B3組：有效組分2μg·ml－1＋ LPS。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7生長(zhǎng)活性的影響

采用MTT法檢測(cè)不同濃度三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7生長(zhǎng)活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1μg·ml－1的LPS，50μg·ml－1、10μg·ml－1、2μg·ml－1的三黃瀉心湯有效組分和250μg·ml－1、50μg·ml－1、10μg·ml－1的三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)活性均無(wú)影響，見(jiàn)表1、2。

2.2 三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7釋放炎性細(xì)胞因子的影響

為了排除三黃瀉心湯對(duì)正常RAW264.7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子可能的直接作用，我們檢測(cè)了不同濃度的三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響。結(jié)果表明：未加三黃瀉心湯時(shí)細(xì)胞上清中 TNF－α濃度為16.076±0.042pg·ml－1，50、10、2μg· ml－1的三黃瀉心湯有效組分和250、50、10μg·ml－1的三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子均無(wú)影響，見(jiàn)表3。

表1 瀉心湯對(duì)raw264.7細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響（±s，n＝6）

表1 瀉心湯對(duì)raw264.7細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響（±s，n＝6）

組別 濃度（μg·ml－1） OD值空白組2.033±0.108瀉心湯 A1 250 2.108±0.171瀉心湯 A2 50 2.044±0.123瀉心湯－A3 10 1.929±0.124

表2 瀉心湯有效組分對(duì)raw264.7細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響（±s，n＝6）

表2 瀉心湯有效組分對(duì)raw264.7細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響（±s，n＝6）

組別 濃度（μg·ml－1） OD值空白組B3 2 1.504±0.182 1.504±0.182瀉心湯有效組分B1 50 1.554±0.166瀉心湯有效組分B2 10 1.651±0.203瀉心湯有效組分－

2.3 三黃瀉心湯對(duì)LPS刺激的RAW264.7釋放炎性細(xì)胞因子的影響

模型組與空白組比較，模型組TNF－α含量顯著增加，達(dá)到753.021pg· ml－1（P＜0.01）。 同 模 型 組 比 較，50、10、2μg·ml－1的有效組分組TNF－α受到不同程度的抑制，但是250、50、10μg·ml－1的瀉心湯組 TNF－α濃度與模型組無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表3。

3 討論

內(nèi)毒素血癥（Intestinal end toxemia，IETM）是由于血中細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌釋放出大量?jī)?nèi)毒素至血液，或輸人大量?jī)?nèi)毒素污染的液體而引起，分為內(nèi)源性和外源性?xún)煞N，其進(jìn)一步發(fā)展可能引起全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）或多功能器官衰竭（MODS）的發(fā)生而導(dǎo)致死亡［4］。其作用機(jī)制是LPS進(jìn)入機(jī)體后，大部分與血漿LPS結(jié)合蛋白（LPS binding protein，LBP）結(jié)合，形成復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)給單核巨噬細(xì)胞膜表面的受體CDl4分子，LPS的信號(hào)傳遞需借助膜上的另一個(gè)受體TLR4（Toll like receptor 4）發(fā)揮內(nèi)毒素的生物學(xué)作用，TLR4在輔助受體CD12的幫助下，經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)，最后激活核因子AP－1和NF－κB。AP－1和NF－κB可介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種生物活性分子，如腫瘤壞死因子（TNF－a）、HMGB1、白細(xì)胞介素（IL）等肽類(lèi)物質(zhì)，白三烯等脂類(lèi)介質(zhì)及一氧化氮等，導(dǎo)致肝臟和其他臟器受損［5］。

表3 三黃瀉心湯對(duì)LPS刺激和未刺激的RAW264.7釋放炎性細(xì)胞因子的影響（±s，n＝6）

表3 三黃瀉心湯對(duì)LPS刺激和未刺激的RAW264.7釋放炎性細(xì)胞因子的影響（±s，n＝6）

注：與模型組比較，＊＊p＜0.01。

TNF－α（pg·ml－1）刺激空白組別 濃度（μg·ml－1）LPS未刺激 LPS 16.076±0.042 22.326±0.992模型 － － 753.021±106.768瀉心湯 A1 250 23.388±2.467 694.732±49.347瀉心湯 A2 50 24.928±2.359 711.843±94.785瀉心湯 A3 10 21.384±5.927 710.151±47.403瀉心湯有效組分B1 50 23.053±6.519 704.299±43.433瀉心湯有效組分B2 10 18.120±0.749 536.479±47.664＊＊瀉心湯有效組分B3 2 19.886±5.079 535.394±74.399－＊＊

腫瘤壞死因子在內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子中，起著關(guān)鍵性作用。有人認(rèn)為在內(nèi)毒素刺激下，TNF－α首先產(chǎn)生、釋放增加，激發(fā)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，造成細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)其他炎癥介質(zhì)，從不同環(huán)節(jié)參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)，引起多器官組織損傷［6］。因此，在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們首先選取TNF－α為監(jiān)測(cè)指標(biāo)。而三黃瀉心湯對(duì)LPS刺激的其他炎癥因子和抗炎因子的作用在以后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將進(jìn)一步研究。

本研究參照其他實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)最終選擇LPS 1μg·ml－1刺激細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型。為了排除三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞因子釋放的抑制作用是其細(xì)胞毒作用所致，我們觀(guān)察了不同濃度三黃瀉心湯對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三黃瀉心湯有效組分可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放TNF－α，各個(gè)濃度的三黃瀉心湯對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，顯示其影響細(xì)胞因子釋放作用與細(xì)胞毒作用無(wú)關(guān)，為三黃瀉心湯能否用于臨床膿毒癥的治療提供了一定的理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50μg·ml－1比10μg·ml－1、2μg·ml－1的三黃瀉心湯有效組分對(duì)LPS刺激的RAW264.7釋放TNF－α的抑制作用弱，這可能與藥物作用機(jī)制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到50μg·ml－1、10μg·ml－1、2μg·ml－1的有效組分組 TNF－α受到不同程度的抑制，但是250μg·ml－1、50μg·ml－1、10μg·ml－1的瀉心湯組TNF－α濃度與模型組無(wú)顯著性差異。這可能與瀉心湯在給藥前的處理過(guò)程有關(guān)，我們將進(jìn)一步對(duì)處理前與處理后三黃瀉心湯的化學(xué)成分與含量進(jìn)行檢測(cè)，探索其原因。

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