非釀酒酵母在葡萄酒生產中的作用及研究進展

李旋，亓桂梅*，王超萍

（山東省葡萄研究院，山東濟南 250100）

葡萄酒是一種發(fā)酵飲料，其釀造過程既是微生物的作用過程，也是酵母菌的發(fā)酵產物。葡萄酒的釀造最初采用的是自然發(fā)酵技術，也就是利用附著在果皮及存在于車間、空氣等環(huán)境中的天然酵母完成發(fā)酵過程，由于此過程是由多種酵母的混合作用，因此對葡萄酒穩(wěn)定性及風味的影響往往難以預測，對此國內外學者進行了較為全面的研究[1-2]，逐漸了解天然釀酒酵母的種類、性能，進行了大量試驗和優(yōu)化[3-4]。近幾十年，隨著科技進步及商業(yè)酵母的推出，釀酒師已經放棄了傳統的自然發(fā)酵法，利用商用酵母進行純種發(fā)酵。商用釀酒酵母具有很多優(yōu)點，能夠耐高酒精度、耐高溫，競爭營養(yǎng)物的能力較強，使葡萄酒的風味更有保障[5]，但不能很好地體現葡萄酒的復雜性和典型性。

葡萄汁中的微生物除釀酒酵母外，還存在一些非釀酒酵母（non-Saccharomycescerevisiae），研究發(fā)現，其代謝產物對葡萄酒的香氣、風味和品質產生重要影響。但由于人們在破敗葡萄酒中分離出了非釀酒酵母，因此認為它們會給葡萄酒釀造帶來不良影響。實際上，非釀酒酵母可以產生甘油、高級醇及其它揮發(fā)性化合物，有利于提升葡萄酒的香氣、風味等感官特征，但也可能會產生不良的氣味和影響[6]。因此，酒商們采用各種方法（例如改善地窖的衛(wèi)生狀況，控制發(fā)酵pH、SO2含量、溫度等）抑制其中的“破壞者”，使“相容者”與釀酒酵母協調作用，釀造出風味更豐富的優(yōu)質葡萄酒。我國對非釀酒酵母菌的研究仍處于起步階段，與國外相比存在較大差距，因此，了解非釀酒酵母的種類和特點，以及對葡萄酒發(fā)酵的影響，對指導葡萄酒生產有重要意義。

1 非釀酒酵母的種類

葡萄酒釀造環(huán)境中，酵母菌廣泛存在于葡萄表面和地窖、設備表面，葡萄破碎過程中，酵母菌被轉移到葡萄汁中[7]。葡萄汁發(fā)酵旺盛時期，受乙醇含量、氧氣缺乏、低pH等因素的影響，大部分非釀酒酵母會死亡；此外，釀酒酵母的接種量、營養(yǎng)限制也會對非釀酒酵母的生存產生影響[8-9]。

研究人員普遍認為，葡萄園中最多的非釀酒酵母是檸檬克勒克酵母（Kloeckera）和有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），占分離菌株的50%～75%[10]。炎熱地區(qū)葡萄園中的非釀酒酵母以有孢漢遜酵母為主，寒冷地區(qū)以檸檬克勒克酵母為主，而中等氣候地區(qū)兩者數量大致相當[11]。非釀酒酵母可以分為3組：（1）好氧型酵母，例如畢赤酵母屬（Pichiaspp.）、德巴利酵母屬（Debaryomycesspp.）、紅酵母屬（Rhodotorulaspp.）、假絲酵母屬（Candidaspp.）、白隱球酵母（Cryptococcus albidus）；（2）低發(fā)酵活性的酵母，例如有孢漢遜酵母、罕見有孢漢遜酵母（Hanseniaspora occidentalis）；（3）高發(fā)酵活性酵母，例如馬克斯克魯維酵母（Kyryveromyces marxianus）、德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、拜氏接合酵母（Zygosac-charomyces bailii）[12-13]。

2 非釀酒酵母的作用

葡萄酒的一類香氣來源于葡萄，二類香氣則來源于酵母發(fā)酵作用形成的各種揮發(fā)性產物及濃度。不同的非釀酒酵母可以產生不同的代謝產物，包括酯類、高級醇、甘油、萜類化合物、琥珀酸、乙酸及乙醛等，這些代謝產物是形成葡萄酒感官特性的風味物質，影響葡萄酒的香氣、口感及酒體[15-17]。

3 非釀酒酵母對葡萄酒成分的影響

3.1 對酒精含量的影響

一項葡萄酒消費者調查顯示，年輕消費者更偏愛酒精度低的葡萄酒，因此，人們對低醇葡萄酒的研究更加關注[18]。有研究表明，利用一些非釀酒酵母的氧化代謝可以降低葡萄酒的酒精含量[19-20]，如在有氧條件下，使用土星擬威爾酵母（Williopsis saturnus）和亞膜漢遜酵母（Pichia subpelliculosa）對葡萄汁進行發(fā)酵后，可獲得3%(v/v)乙醇含量的葡萄酒，其品質也被廣大消費者接受[21]。

3.2 對葡萄酒風味物質的影響

早期研究人員認為非釀酒酵母不適合葡萄酒發(fā)酵，但隨著深入研究，人們發(fā)現一些種屬如假絲酵母、克勒克酵母或有孢漢遜酵母，可以通過代謝和自溶來提高葡萄酒的香氣，參與復雜風味物質的形成。國外對不同非釀酒酵母產生的風味化合物的研究比較多，已經被證實具有增加葡萄酒香氣的作用。

3.2.1 酯類

人們已經從葡萄酒中鑒定出超過160種酯類，這些酯類可以對葡萄酒質量產生積極影響。通常情況下，非釀酒酵母可以比釀酒酵母產生更多的酯類，這也是自然發(fā)酵的葡萄酒比接種發(fā)酵的葡萄酒成分更復雜的原因，研究發(fā)現，有孢漢遜酵母和畢赤酵母具有很好的產乙酸酯（白葡萄酒的主要揮發(fā)性香味物質）的能力，此外，產酯高的非釀酒酵母還包括異常畢赤酵母、異常漢遜酵母和檸檬克勒克酵母。有研究表明，發(fā)酵過程中克勒克酵母數量較少是導致西班牙巴斯克（Basque）地區(qū)白福爾葡萄酒缺乏復雜香氣的原因之一[22]。

3.2.2 高級醇

不同非釀酒酵母會產生不同含量的高級醇（正丙醇、異丁醇、異戊醇、旋性戊醇）[23]。通常高級醇在餐后葡萄酒中的含量并不希望過高，但如果濃度過低也會帶來不醇厚和單調的味感，有研究表明，非釀酒酵母比釀酒酵母產生高級醇的量更少，但不同菌株之間存在很大差異[24]。

3.2.3 甘油

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甘油是酵母在葡萄酒發(fā)酵中的代謝產物，有助于提高葡萄酒的順滑感、甜度和復雜性。星形假絲酵母（Candida stellatta）和檸檬形克勒克酵母可產大量的甘油，調節(jié)細胞內的氧化還原電位，賦予葡萄酒柔和性、甜度和黏稠度，目前一些國家鼓勵生產甘油含量高的葡萄酒，但是，甘油對不同類型葡萄酒的影響程度不同[25]。

3.2.4 萜烯醇

萜烯及萜烯醇類對葡萄品種特有香氣的形成至關重要，如麝香葡萄的香氣便是萜烯帶來的。研究發(fā)現，使用德爾布有孢圓酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵‘長相思’葡萄汁，所獲得的葡萄酒與使用釀酒酵母單一發(fā)酵的葡萄酒相比，萜烯醇的濃度更高?？梢?，一些非釀酒酵母對葡萄酒中萜烯醇類濃度的增加具有顯著效果[26]。

3.2.5 其他風味物質

葡萄酒中已知的風味物質超過680種[27]，這些風味化合物以糖基化的前體物質存在，可以被β-葡萄糖苷酶水解形成游離揮發(fā)物，改善酒的風味，但釀酒酵母基因組無法編碼產生β-葡萄糖苷酶[28]，而一些非釀酒酵母菌則可以產生，并在非揮發(fā)性前體物質釋放成揮發(fā)性化合物方面發(fā)揮著重要作用，例如德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬和克勒克酵母屬等[29]。

3.3 對葡萄酒酸度的影響

葡萄酒的酸度源于葡萄中酒石酸和蘋果酸，以及發(fā)酵產生的琥珀酸、乳酸和乙酸。為了降低葡萄酒的乙酸含量，研究人員使用德爾布有孢圓酵母和釀酒酵母進行混合發(fā)酵，結果表明，以德爾布有孢圓酵母與釀酒酵母＝20∶1的比例接種進行混合發(fā)酵，所釀制的葡萄酒揮發(fā)性酸和乙醛分別減少53%和60%[30]。一些非釀酒酵母還可以產生琥珀酸[31]，琥珀酸可以通過提高葡萄酒的總酸度來提升葡萄酒的特性。一般非釀酒酵母比釀酒酵母產生的琥珀酸更多，但各菌屬產量各不相同，在產琥珀酸的酵母中，最主要的酵母是星形假絲酵母。值得注意的是，琥珀酸具有“鹽苦味”，過量會對葡萄酒質量產生不利影響。

研究發(fā)現，使用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）可以減少葡萄酒中蘋果酸的含量[32-33]。研究人員使用粟酒裂殖酵母和釀酒酵母進行混合發(fā)酵，改善了酵母菌之間的競爭，并減少了由粟酒裂殖酵母引起的消極感官特征；粟酒裂殖酵母的突變體還達到了葡萄酒降酸的效果[34]。此外，使用固定化的粟酒裂殖酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵控制生物脫酸的效果更好，在這個過程中，釀酒酵母幾乎可以使用所有可用的糖進行發(fā)酵，固定化的粟酒酵母細胞則使用蘋果酸，消除了粟酒裂殖酵母對葡萄酒品質的不良影響[35]。

3.4 對葡萄酒顏色的影響

葡萄酒的顏色也會受非酵母菌酵母的影響，但國內外的相關研究并不多。有研究表明，使用季也蒙畢赤酵母（P. guillier-mondii）和釀酒酵母混合發(fā)酵，可以增加提高顏色穩(wěn)定性的酚醛吡喃花青素分子的形成[36]，其他非釀酒酵母對葡萄酒顏色的作用還有待確定。

3.5 對細菌的影響

除了影響葡萄酒的酒精含量、風味和顏色外，非釀酒酵母也會影響葡萄酒細菌的生長和活性。蘋果酸-乳酸發(fā)酵是葡萄酒生產難以控制的二次發(fā)酵過程，通常在糖分轉化為酒精之后正式開始[37]，但自發(fā)進行的蘋果酸-乳酸發(fā)酵的結果往往難以預測，甚至引起葡萄酒的腐敗[38]?；旌习l(fā)酵中，非釀酒酵母在發(fā)酵初期消耗必需的營養(yǎng)物質，抑制二次發(fā)酵所需乳酸菌的生長，發(fā)酵后期形成的其他副產物促進乳酸菌的生長，因此，可以利用非釀酒酵母控制葡萄酒二次發(fā)酵的開始時間，較少葡萄酒的腐敗現象。

4 混合發(fā)酵中酵母菌的相互作用

非釀酒酵母在葡萄酒生產中完全發(fā)酵的能力不夠，產酒精的能力也稍差，但如果完全抑制非釀酒酵母則會降低葡萄酒香氣的復雜性[39]。近年來，在葡萄酒釀造過程中同時添加釀酒酵母和非釀酒酵母已經成為改善葡萄酒品質的有效方法[40-41]?；旌习l(fā)酵中的各種酵母菌并不是被動共存的，而是相互作用并產生不可預料的化合物，從而影響葡萄酒的化學組成。例如，在檸檬形克勒克酵母的絮狀菌株與釀酒酵母的非絮狀菌株的混合發(fā)酵中，酵母菌之間的相互作用可以誘導產生共絮凝[42-43]。絮凝性是微生物的一個重要特性，發(fā)酵臨近結束時，大量微生物細胞絮凝在一起結塊沉下，發(fā)酵液因而得到澄清。絮凝性能良好的微生物，發(fā)酵結束時能迅速沉淀，不僅降低分離細胞所耗的能源，而且可以避免細胞長時間懸浮于發(fā)酵液中造成自溶的危險[44]。

此外，研究人員使用耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和釀酒酵母混合發(fā)酵實現了生物降酸[45]；使用釀酒酵母和法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniaspora valbyensis)混合發(fā)酵控制接種時間，有效增加了乙酯類物質含量，降低了乙醇含量[46]。

總之，非釀酒酵母具有釀酒酵母所不具有的特殊釀酒特性，并且可以對葡萄酒發(fā)酵產生疊加效應?；旌习l(fā)酵可以通過酵母菌之間的代謝相互作用，改善葡萄酒的組成和香氣。

5 發(fā)展趨勢

酵母菌是葡萄酒生產中的主要微生物，通過一系列代謝機制和活動影響葡萄酒風味物質的形成[47]，酵母菌種的選擇是提高葡萄酒感官質量的重要途徑。我國對于非釀酒酵母影響葡萄酒香氣機理的研究尚處于起步階段，分離篩選具有我國產區(qū)特色的非釀酒酵母是今后葡萄酒產業(yè)發(fā)展的趨勢[48]。

目前，研究人員已經對天然酵母和商業(yè)酵母的生物學特性進行了研究，并探索了基因表達方法和基因組分析，還在mRNA和蛋白質水平上研究了酵母細胞對葡萄酒發(fā)酵條件的適應性，但非釀酒酵母的相關研究并不多，需要深入研究非釀酒酵母的遺傳和代謝調控方面的問題。此外，混合發(fā)酵的管理比單一發(fā)酵的管理更復雜，我們對釀酒酵母與非釀酒酵母之間代謝相互作用的了解還非常有限，因此，發(fā)酵期間不同菌種之間相互作用及接種方式的影響還需進一步加強。