潘旭鳴 陳丹壘 馬紅珍
缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是指組織或器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后損傷反而加重,甚至出現(xiàn)損傷不可逆的現(xiàn)象。組織或器官缺血后缺氧,從而產(chǎn)生損害,但再灌注后卻可能因?yàn)榛钚匝踉诮M織或器官中的再度富集而造成二次損傷。研究發(fā)現(xiàn),腎臟IRI是導(dǎo)致急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的主要原因之一[1]。缺血所致的低氧過(guò)程,與再灌注誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)激活共同成為腎組織損傷的原因,而IRI不可避免的存在于腎臟移植、心臟外科手術(shù)等過(guò)程中。盡管臨床對(duì)腎臟IRI的研究頗多,但其確切機(jī)制尚未闡明,亦未發(fā)現(xiàn)良好的防治方法。
miRNA最早于1993年由Ambros研究小組在秀麗線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)[2],其后miRNA被證實(shí)在各類物種中均具有高度的保守性。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用,并且參與了幾乎所有細(xì)胞的生物學(xué)功能,包括細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等[3],可與靶基因mRNA 3'端非編碼區(qū)完全或不完全結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白質(zhì)合成[4]。迄今為止,人類基因組已發(fā)現(xiàn)超2 000個(gè)miRNA。在生物體內(nèi),miRNA的特異性不強(qiáng),一個(gè)miRNA可以作用于多個(gè)靶基因,包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、受體等,占人類基因1%的miRNA可能調(diào)控30%以上其他基因的表達(dá),多個(gè)miRNA也可以共同調(diào)控一個(gè)靶基因的表達(dá),因此,miRNA與靶基因之間組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[4]。近年來(lái),miRNA也被發(fā)現(xiàn)在疾病的診斷與治療中扮演關(guān)鍵的角色。本文就miRNA在腎臟IRI中的作用研究進(jìn)展綜述如下。
腎臟IRI是造成患者發(fā)生AKI的主要原因,膿毒血癥、休克、腎動(dòng)脈狹窄、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)或腎移植術(shù)等都可以通過(guò)腎臟IRI誘發(fā)AKI,其致死率與致殘率較高。從病理上看,腎臟IRI以腎小管間質(zhì)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn),尤其以近曲小管損傷多見,并伴有小管上皮細(xì)胞的凋亡壞死與修復(fù)過(guò)程[5]。腎臟IRI可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)炎癥、細(xì)胞凋亡與壞死、細(xì)胞修復(fù)能力減弱等,也可以通過(guò)激活免疫應(yīng)答反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷[6-7],其中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬在損傷發(fā)生過(guò)程中有著不可替代的作用。
1.1 炎癥反應(yīng)介導(dǎo)腎臟IRI 炎癥反應(yīng)在腎臟IRI過(guò)程中與各種類型細(xì)胞均有關(guān),并且在病理生理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腎臟IRI會(huì)啟動(dòng)腎臟組織及細(xì)胞內(nèi)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),并導(dǎo)致?lián)p傷,因此抑制炎癥反應(yīng)是保護(hù)腎臟組織免受IRI的重要思路之一[8]。趨化因子是炎癥反應(yīng)中重要的中介分子之一,在炎癥反應(yīng)中起到調(diào)節(jié)并活化促炎因子,增強(qiáng)黏附分子表達(dá)的作用[9]。促炎因子如IL-6、TNF-α等在腎臟IRI致腎功能障礙過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。研究顯示,抑制IL-6及TNF-α表達(dá)后,可以在細(xì)胞水平減輕IRI導(dǎo)致的腎臟損傷[10-11]。同時(shí),炎癥介質(zhì)、活性氧簇以及細(xì)胞黏附分子如細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(ICM-1)、P-選擇素等,可以通過(guò)募集白細(xì)胞與中性粒細(xì)胞至發(fā)生缺血的組織處,增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞腫脹并進(jìn)一步阻礙血液的運(yùn)行[12-13],加重腎臟損傷。
1.2 氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)腎臟IRI 在腎臟IRI過(guò)程中,損傷的組織可以產(chǎn)生大量的活性氧簇,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生,線粒體發(fā)生氧化磷酸化障礙,ATP生成減少,激活磷脂酶,造成生物膜損傷,細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流而導(dǎo)致鈣超載[14]。當(dāng)血液再灌注后,產(chǎn)生大量的氧自由基,導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),進(jìn)而產(chǎn)生自由基介導(dǎo)的組織損傷[15]。自由基形成所導(dǎo)致的組織損傷借助膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)與蛋白質(zhì)、DNA的氧化損傷可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程[16]。因此,抑制自由基及其相關(guān)產(chǎn)物可以有效保護(hù)IRI的腎組織,減少損傷。
1.3 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬介導(dǎo)腎臟IRI 腎小管上皮細(xì)胞因急性缺血而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬反應(yīng)是低血容量、低血壓、心力衰竭等的共同病理環(huán)節(jié)[17]。腎小管上皮細(xì)胞壞死會(huì)引起水、電解質(zhì)、大分子物質(zhì)在細(xì)胞間擴(kuò)散失控,造成腎小管濾過(guò)時(shí)產(chǎn)生回漏,使腎小球?yàn)V過(guò)率降低。研究發(fā)現(xiàn),眾多分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腎小管上皮細(xì)胞壞死、凋亡及自噬相關(guān)。如p53-sestrin2信號(hào)通路及HIF-1α-BCL2信號(hào)通路等,均可在缺血的刺激下啟動(dòng)并激活,進(jìn)一步改變腎小管上皮細(xì)胞的自噬及凋亡水平,具有潛在的保護(hù)作用[18]。低氧可以誘導(dǎo)mTOR及unc-51樣自噬激活激酶1(ULK1)解離,誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生[19-20]。細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),ULK1與AMPK、c-jun、beclin-1等信號(hào)分子存在交互作用,從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬過(guò)程[19-22]。
近年來(lái),尋找新型的生物標(biāo)志物成為腎臟IRI研究的主要熱點(diǎn)之一。miRNA的表達(dá)不僅可以逆轉(zhuǎn)腎臟IRI,保護(hù)腎臟功能,更可以作為腎臟IRI診斷與鑒別診斷的生物標(biāo)志物。腎臟IRI過(guò)程中miRNA的動(dòng)態(tài)變化、其組織特異性表達(dá)模式與分析方法,甚至其在尿液和血液中的不同分布,均使得miRNA成為腎臟疾病生物標(biāo)志物的理想候選者[23-24]。有學(xué)者對(duì)大鼠發(fā)生腎臟IRI后不同時(shí)間點(diǎn)的血清及腎組織miR-192進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)血清miR-192水平提高4倍但腎組織miR-192水平下降40%;該研究團(tuán)隊(duì)又選取93例心臟手術(shù)后患者血清進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn),心臟手術(shù)術(shù)后發(fā)生AKI的患者血清miR-192水平在進(jìn)入ICU的同時(shí)開始升高,并在2h內(nèi)維持穩(wěn)定,24h后開始下降[25],提示血清miR-192可以成為預(yù)測(cè)心臟手術(shù)后發(fā)生腎臟IRI的生物標(biāo)志物之一。亦有研究指出,在小鼠IRI中,尿液miR-10a、miR-30d濃度與發(fā)生IRI后小鼠尿液中KIM-1及NGAL濃度呈正相關(guān),反映了尿miR-10a與miR-30d濃度與小鼠IRI嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[26]。在一項(xiàng)22例腎臟IRI患者的研究中發(fā)現(xiàn),腎臟IRI患者尿miR-21水平是正常對(duì)照組的1.5倍,而尿miR-155水平則相較正常對(duì)照組顯著降低,提示尿miR-21與miR-155均可以有效鑒別患者是否發(fā)生腎臟IRI,并具有一定的診斷效能[27]。
部分miRNA被臨床驗(yàn)證可作為腎臟IRI所致AKI的診斷生物標(biāo)志物外,亦有大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以作為信號(hào)分子參與腎臟IRI發(fā)生機(jī)制與病理生理過(guò)程,反映了其作為潛在的治療靶點(diǎn)的生物學(xué)功能。
3.1 調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng) 腎臟IRI過(guò)程中,由于細(xì)胞、組織缺血缺氧導(dǎo)致自由基、活性氧簇等大量激活,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn),部分miRNA可以阻斷這一過(guò)程,減輕缺血及再灌注階段對(duì)腎臟的損傷,降低腎功能受損程度。Muratsu-Ikeda等[28]采用低氧誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞模型,模擬腎臟缺血缺氧環(huán)境后發(fā)現(xiàn),低氧誘導(dǎo)后,細(xì)胞內(nèi)miR-205水平明顯下調(diào),敲除細(xì)胞內(nèi)miR-205基因后,HK-2細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)低氧環(huán)境更高的敏感性,對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性也相對(duì)升高,相對(duì)未敲除組細(xì)胞損傷程度更嚴(yán)重,細(xì)胞活力更差,補(bǔ)充miR-205后細(xì)胞活力有所恢復(fù)。進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn),miR-205可以與細(xì)胞內(nèi)脯氨酸羥化酶1(PHD1)結(jié)合,從而降低HK-2細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境及氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感性,最終提高細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的耐受性。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),在大鼠腎臟 IRI 后,miR-29a[29]、miR-34a[29]、miR-423-5p[30]、miR-320[31]在腎臟組織內(nèi)的表達(dá)水平與腎臟組織氧化應(yīng)激水平同步上調(diào),在使用間充質(zhì)干細(xì)胞治療后腎臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平及miR-29a、miR-34a均有所下降[29];抑制大鼠腎臟組織miR-423-5p表達(dá)后,大鼠腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕,腎臟損傷較未抑制的大鼠明顯減小,miR-423-5p可能通過(guò)抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),減弱組織細(xì)胞損傷修復(fù),從而造成組織損傷[30];而miR-320水平上調(diào)所致的腎臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)與腎臟損傷表現(xiàn)均可以被卡托普利逆轉(zhuǎn)[31]。
3.2 參與炎癥反應(yīng) 腎臟IRI過(guò)程中,在缺血缺氧階段,炎癥反應(yīng)開始迅速啟動(dòng),并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)而造成腎臟損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),腎臟IRI后,miR-21水平顯著升高,通過(guò)抑制PTEN蛋白水平[32],激活PI3K/AKT通路,從而抑制腎臟IRI過(guò)程中炎癥因子的產(chǎn)生,減輕腎臟損傷[33]。同時(shí),miR-21可以抑制絲裂原活化蛋白激酶3(MKK3)從而降低腎組織IL-6、TNF-α水平,減輕炎癥反應(yīng),保護(hù)腎臟,減輕IRI[34]。Lan等[35]在小鼠腎臟IRI過(guò)程中發(fā)現(xiàn),小鼠腎臟組織miR-494水平在IRI后1h開始升高,進(jìn)一步研究證實(shí),miR-494可以直接抑制轉(zhuǎn)錄因子ATF3,誘導(dǎo)炎癥因子及黏附分子如 IL-6、P-選擇素、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)大量表達(dá),加劇IRI后腎臟損傷。在利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療腎臟血管性疾病的研究中發(fā)現(xiàn),miR-26a可以抑制腎血管內(nèi)TNF-α表達(dá),升高IL-10水平,產(chǎn)生一定的抗炎作用[36]。而慢病毒轉(zhuǎn)染miR-26a基因的小鼠在腎臟IRI后可以抑制IL-6表達(dá)并刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成,減輕腎臟炎癥反應(yīng),促進(jìn)腎臟IRI后功能的恢復(fù)[37]。對(duì)miR-146a敲除小鼠進(jìn)行腎臟IRI過(guò)程模擬后發(fā)現(xiàn),miR-146a可以通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1受體相關(guān)酶1,從而影響CXCL8/CXCL1信號(hào)通路,相較于野生型小鼠,miR-146a基因敲除小鼠在腎臟IRI后,表現(xiàn)出更輕的腎小管損傷,更低的NF-κB等炎癥因子水平[38]。
3.3 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬水平 在腎臟IRI過(guò)程中,缺血缺氧及再灌注后導(dǎo)致的自由基損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)最終均可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞自噬及凋亡反應(yīng)產(chǎn)生,產(chǎn)生腎臟損傷。在低氧誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn),miR-21可以抑制細(xì)胞自噬。小鼠腎臟IRI模型中發(fā)現(xiàn),miR-21基因敲除后,小鼠腎臟程序性細(xì)胞凋亡蛋白4(PCDP4)明顯上調(diào),加速細(xì)胞凋亡,加重腎臟IRI[39]。Cui等[40]對(duì)IRI小鼠腎臟組織進(jìn)行miRNA芯片分析后發(fā)現(xiàn),小鼠腎臟在IRI后miR-18a、miR-210表達(dá)明顯異常,PTEN基因是miR-18a的目標(biāo)基因,與p53凋亡信號(hào)通路有關(guān),miR-210的靶基因?yàn)閎cl2,同樣可以調(diào)控細(xì)胞凋亡程度,影響腎臟IRI發(fā)生、發(fā)展。在腎臟IRI過(guò)程中,miR-687可以抑制PTEN蛋白,促進(jìn)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡[41]。Hao等[42]發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟IRI后體內(nèi)miR-17-5p水平明顯升高。進(jìn)行低氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),缺氧后細(xì)胞內(nèi)miR-17-5p水平升高,依賴p53蛋白作用,直接抑制死亡受體6(DR6),減輕低氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,提示p53/miR-17-5p/DR6通路可能是小鼠IRI的重要發(fā)生機(jī)制之一。另有小鼠腎臟IRI實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-34a在小鼠IRI后表達(dá)上調(diào),可以通過(guò)結(jié)合Atg4B基因的3′非編碼區(qū),直接抑制腎小管上皮細(xì)胞的自噬活性,從而加重腎臟IRI[43]。Lorenzen等[44]發(fā)現(xiàn),腎移植后發(fā)生急性排異反應(yīng)的患者血miR-24水平明顯上調(diào),后在離體細(xì)胞模型中證實(shí),低氧誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞后可以觀察到miR-24在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)特異性富集,并直接參與細(xì)胞凋亡過(guò)程,故推測(cè)抑制miR-24可能成為治療腎臟IR的靶點(diǎn)之一。
在腎臟IRI動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn),部分miRNA具有促進(jìn)腎臟IRI恢復(fù)的作用。Zheng等[45]建立大鼠腎臟IRI模型后發(fā)現(xiàn),miR-381在腎小管上皮細(xì)胞中可特異性結(jié)合CXCR4基因,抑制CXCR4基因及其相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)如SDF1、VEGF、HIF-1α等,從而增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞增殖,減輕上皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)大鼠腎臟IRI恢復(fù)。Song等[46]建立了特異性敲除小管上皮細(xì)胞miR-17-92小鼠模型,并對(duì)其造成腎臟IRI,結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲除miR-17-92的小鼠腎臟缺血再灌注后損傷程度較正常小鼠更為強(qiáng)烈,在外源性補(bǔ)充miR-17-92后可以部分逆轉(zhuǎn)缺血再灌注造成的腎臟損傷,提示miR-17-92具有潛在治療腎臟IRI的作用。
HIF活化在IRI缺血或者低氧階段起重要的作用[47]。HIF的轉(zhuǎn)錄活性受HIF-α特定殘基的翻譯后羥化作用調(diào)節(jié)。HIF的靶點(diǎn)包括負(fù)責(zé)血管舒縮調(diào)節(jié)基因(如腎上腺髓質(zhì)素、eNOS、血紅素加氧酶)、能量代謝(如GLUT-1、碳酸酐酶-9)、血管生成的信號(hào)(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1)和細(xì)胞保護(hù)作用(如腎上腺髓質(zhì)素、促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、HSP70)。因此,適當(dāng)激活HIF可以改善缺血細(xì)胞存活狀態(tài),并促進(jìn)有益的適應(yīng)性變化。抑制HIF-1α羥化酶從而穩(wěn)定甚至激活HIF已成為許多疾病如心肌缺血、缺血性腦卒中和急、慢性腎損傷的治療策略與研究熱點(diǎn)之一[48-49]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA可受HIF-1α調(diào)控從而影響腎臟IRI過(guò)程。Aguado-Fraile等[50]發(fā)現(xiàn),在大鼠腎臟IRI模型中,大鼠miR-127明顯上調(diào),進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,miR-127上游受HIF-1α調(diào)控,下游調(diào)控驅(qū)動(dòng)蛋白家族3B(KIF3B),參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞內(nèi)骨架穩(wěn)定及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子傳導(dǎo)等生理活動(dòng)。Wang等[51]通過(guò)低氧誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞模擬腎臟IRI過(guò)程發(fā)現(xiàn),低氧損傷后HK-2細(xì)胞內(nèi)miR-20a-5p水平顯著減少,并發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p受HIF-1α調(diào)控,并可以與自噬相關(guān)16樣蛋白1(ATG16L1)的mRNA的3′端相結(jié)合,從而影響腎臟IRI過(guò)程中細(xì)胞自噬水平。Wei等[52]研究表明,腎臟IRI過(guò)程中HIF-1α可以通過(guò)減少miR-489的生成,增加細(xì)胞凋亡水平從而加重腎臟IRI損傷。Bhatt等[41]亦觀察到miR-687在小鼠腎臟IRI過(guò)程中受HIF-1誘導(dǎo),并通過(guò)HIF-1/miR-687/PTEN信號(hào)通路在小鼠腎臟IRI過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞凋亡。
腎臟組織不同類型的細(xì)胞可能在不同的腎臟疾病中受到影響。為了解miRNA發(fā)揮的具體病理生理作用,有必要確定在具體腎臟疾病的情況下表達(dá)此miRNA的細(xì)胞類型。具有條件性過(guò)度表達(dá)或基因敲除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可能是研究miRNA在腎臟疾病中的作用和調(diào)控的最佳模型。在一定條件下識(shí)別miRNA調(diào)控及其靶基因變化的意義是目前臨床難點(diǎn),因?yàn)閱蝹€(gè)蛋白質(zhì)可以由多個(gè)miRNA調(diào)控,單個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)蛋白質(zhì)。雖然miRNA對(duì)腎臟IRI的調(diào)節(jié)是一個(gè)令人興奮的新興研究領(lǐng)域,但更重要的是需要建構(gòu)腎臟IRI過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的變化,并完善miRNA-mRNA在腎臟IRI過(guò)程中的網(wǎng)狀對(duì)應(yīng)作用。最終,通過(guò)信號(hào)通路分析等明確每一個(gè)miRNA在腎臟IRI過(guò)程中的具體靶點(diǎn)、作用機(jī)制及病理生理影響。值得注意的是,目前鑒定出的大多數(shù)miRNA都是差異表達(dá)的,并可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、自噬等來(lái)抑制損傷反應(yīng),這可能為臨床指明了靶向調(diào)節(jié)腎臟IRI的新思路;同時(shí)也應(yīng)該注意到HIF與miRNA之間的相互作用等新的IRI機(jī)制成為研究熱點(diǎn)的可能性;其次,在腎臟IRI的研究中,使用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)miRNA進(jìn)行芯片檢測(cè)及通路分析的研究尚不豐富,芯片數(shù)據(jù)的檢測(cè)以及生物數(shù)據(jù)的挖掘?qū)?lái)可能成為腎臟病研究的熱點(diǎn)之一,也符合目前提倡的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念,期待在今后的腎臟IRI研究中看到更多相關(guān)研究。