食品中微生物污染分析及其檢測技術(shù)

□孟云 3M中國有限公司

□張燕 北京家樂福商業(yè)有限公司

由于國內(nèi)食品安全問題種類繁多，本文挑選目前關(guān)注度較高且風(fēng)險較高的微生物污染進(jìn)行分析，并將微生物污染分為3類，即細(xì)菌污染、真菌污染和病毒污染。筆者剖析以上3種微生物污染的危害及對食品行業(yè)和消費(fèi)者的影響，介紹主流食源性致病菌微生物檢測技術(shù)，包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)及現(xiàn)代檢測技術(shù)等多種檢測方法，并分析各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如傳統(tǒng)的培養(yǎng)基方法、測試片方法、顯微鏡檢測法、分子生物學(xué)方法、酶聯(lián)免疫法及ATP生物熒光法等經(jīng)典方法，以期為廣大食品檢測者提供選擇參考性依據(jù)。

食品安全是全球廣泛關(guān)注的問題，近年來我國也屢屢發(fā)生因食品污染引發(fā)的食物中毒事件，而2008年的三鹿奶粉事件更加促使人們對食品安全的進(jìn)一步關(guān)注。有統(tǒng)計顯示，在影響中國食品安全的諸多因素中，微生物污染高居首位。根據(jù)中國衛(wèi)生部通報，在我國1990～1999年間發(fā)生的食物中毒事件中，微生物食物中毒居各類食物中毒病原的首位，是威脅中國食品安全的頭號殺手。2007年報告的食物中毒事件中，微生物食物中毒的人數(shù)占總數(shù)的58.86%。

1 食品中微生物污染的特點(diǎn)及其危害性

食品的微生物污染通常由一些致病微生物引起，主要包括細(xì)菌、真菌和病毒3類。由于微生物具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，食品原料在種植、收獲、飼養(yǎng)、捕撈、加工、包裝、運(yùn)輸、銷售、保存及食用等眾多環(huán)節(jié)都可能被微生物污染。同時，微生物具有易變異性，未來可能不斷有新的病原微生物威脅食品安全和人類健康。相較于其他化學(xué)污染來說，食品易受微生物污染的特點(diǎn)是與生俱來的，由于微生物在空氣、水、人體等環(huán)境中無所不在，這使其成為食品加工過程中無法杜絕污染的因素之一。可以說，現(xiàn)代食品安全管理中，微生物污染是頭等大事，食品生產(chǎn)者必須足夠重視，才有可能將其危害控制在安全水平之下。

1.1 細(xì)菌性污染

細(xì)菌性污染是涉及面最廣、影響最大、問題最多的一類食品污染，其引起的食物中毒在所有食物中毒中具有普遍性并極具爆發(fā)性。細(xì)菌性食物中毒全年皆可發(fā)生，具有易發(fā)性和普遍性等特點(diǎn)，對人類健康有較大的威脅。

引起食品污染的微生物主要有沙門氏菌、副溶血性弧菌（Bibrio parahemolyticus）、 志 賀 菌（Shigella）、葡萄球菌等。近年來，變形菌屬、李斯特菌（Listeria）、大腸菌科、弧菌屬（Vibrio）引起的食品污染呈上升趨勢：美國1999年沙門氏菌發(fā)病1400萬例，住院16430人，死亡582人，損失達(dá)23億美元，其中96%的患者由于攝入受污染食物而被感染；1992年印度爆發(fā)霍亂弧菌（Vibrio comma）O139中毒事件，波及孟加拉、巴基斯坦等許多國家；1996年5～8月，日本爆發(fā)大腸桿菌O157中毒事件，中毒人數(shù)過萬，死亡11人；1999年在美國、2000年在法國也發(fā)生過李斯特菌中毒事件……根據(jù)美國食品和藥物管理局（FDA）統(tǒng)計，2000～2005年，美國共有470人因飲用生牛奶而感染埃希氏大腸桿菌，總共發(fā)生中毒事件18起，涉及16個州。我國食品的細(xì)菌性污染現(xiàn)象也非常普遍，其主要是由蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、副溶血性弧菌和沙門氏菌等微生物引起的食物中毒事件。

1.2 真菌性污染

真菌在發(fā)酵食品行業(yè)的應(yīng)用非常廣泛，但許多真菌也會產(chǎn)生真菌毒素，從而引起食品污染。尤其是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)致癌性的黃曲霉素以來，真菌與真菌毒素對食品的污染日益引起各方重視。真菌毒素不僅具有較強(qiáng)的急性毒性和慢性毒性，還具有致癌、致畸、致突變性，如黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的黃曲霉素，麥角菌（Claviceps purpurea）產(chǎn)生的麥角堿，以及雜色曲霉（Aspergillus versicolor）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）產(chǎn)生的雜色曲霉素等。真菌毒素的毒性可以分為神經(jīng)毒、肝臟毒、腎臟毒、細(xì)胞毒等，如黃曲霉素具有強(qiáng)烈的肝臟毒，可以引起肝癌。

常見的產(chǎn)毒真菌主要有曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、鐮刀菌（Fusarium）、交鏈孢霉（Alternaria）等。由于真菌生長繁殖及產(chǎn)生毒素需要一定的溫度與濕度，因此真菌性食物中毒往往有較為明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。在我國北方地區(qū)食品中黃曲霉素B1污染較輕，而長江沿岸和長江以南地區(qū)則較重。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肝癌等癌癥的發(fā)病率與當(dāng)?shù)氐募Z食霉變現(xiàn)象有一定關(guān)系。

1.3 病毒性污染

與細(xì)菌、真菌不同，病毒的繁殖離不開宿主，所以病毒往往先污染動物性食品，然后通過宿主、食物等媒介進(jìn)一步傳播。帶有病毒的水產(chǎn)品、患病動物的乳/肉制品一般是病毒性食物中毒的起源。同細(xì)菌、真菌引起的病變相比，食源性病毒引發(fā)的疾病更加難以得到有效治療，且更容易爆發(fā)流行。

常見食源性病毒主要有甲型肝炎病毒（HepatitisA）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E）、輪狀病毒（Rotavirus）、諾瓦克病毒（Norwalk）、朊病毒（Prion）、禽流感病毒（Avian influenza）等，這些病毒曾經(jīng)或仍在肆虐，造成了許多重大的疾病群發(fā)事件。1988年初，上海市區(qū)居民因食用被甲型肝炎病毒污染的毛蚶（Scapharca subcrenata）而導(dǎo)致甲型肝炎爆發(fā)流行，發(fā)病人數(shù)達(dá)30萬；由朊病毒引起的瘋牛病于1986年首先在英國被確認(rèn)，迄今為止，全球共有100余人死于這一病癥，據(jù)估計，西歐已有50萬人被瘋牛病病毒所感染；自H5N1型高致病性禽流感病毒引起的禽流感疫情爆發(fā)以來，全球各地不乏有死亡病例報道；美國目前每年約有2300萬例諾瓦克（諾如）病毒性胃腸炎。

2 食品中微生物的檢測技術(shù)及其趨勢

2.1 傳統(tǒng)檢測方法

2.1.1 瓊脂平板培養(yǎng)法

因培養(yǎng)基不同，瓊脂平板法分為選擇性培養(yǎng)基檢測法和顯色培養(yǎng)基檢測法。選擇性培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制劑來抑制非目標(biāo)微生物生長；顯色培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入細(xì)菌特異性酶的顯色底物，以菌落顏色區(qū)分目的菌落與非目的菌落。

2.1.2 顯微鏡鏡檢法

將待測樣品中的微生物富集后，于油鏡下直接計數(shù)。顯微鏡鏡檢法通常與瓊脂平板培養(yǎng)法結(jié)合使用，通過瓊脂平板培養(yǎng)法對菌落進(jìn)行定性分析，再用顯微鏡進(jìn)行定量計數(shù)。傳統(tǒng)檢測方法雖然對設(shè)備要求不高，技術(shù)含量也偏低，但耗時長，人工消耗量大，一般檢測實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況合理挑選檢測方法，無需拘泥于方法選擇的形式。

2.1.3 微生物測試片檢測技術(shù)

一般情況下，微生物測試片由印有網(wǎng)格的聚丙烯薄膜和覆蓋有培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)的聚乙烯薄膜組成。待測樣品經(jīng)過處理后可直接接種在微生物測試片上，然后放置在適宜的溫度下培養(yǎng)——使固定在測試片上的顯色物質(zhì)與待檢微生物生長產(chǎn)生的特異性酶發(fā)生顯色反應(yīng)，形成有顏色的菌落，通過對這些菌落進(jìn)行計數(shù)便可實(shí)現(xiàn)檢測。測試片法菌落典型，易于判讀，且因其操作簡便、計數(shù)直觀，多數(shù)可縮短培養(yǎng)周期從而快速得到結(jié)果，而且人為操作環(huán)節(jié)較少，商品化程度高，避免了因人為因素造成誤差較大的缺點(diǎn)。

測試片法是最為成熟的食源性微生物快速檢測方法之一。對于一些熱敏感的細(xì)菌，由于測試片在整個操作過程中均處于常溫環(huán)境，可有效避免熱損傷，因此能夠提供更加精準(zhǔn)的計數(shù)結(jié)果。目前，市場上較為成熟的系列微生物測試片主要生產(chǎn)廠家包括美國3M公司、德國默克公司、北京陸橋公司、北京良潤生物科技有限公司等，該測試片可分別檢測菌落總數(shù)、大腸菌群及大腸桿菌計數(shù)、霉菌和酵母計數(shù)、腸桿菌科計數(shù)、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等，且微生物測試片與傳統(tǒng)檢測方法之間的相關(guān)性非常好，均可達(dá)統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。目前，因其快速簡便的特性，故已廣泛應(yīng)用于我國食品行業(yè)和環(huán)境、過程及成品的檢測。但是，由于我國國標(biāo)的現(xiàn)狀——檢測方法為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，所以目前該方法僅用于工廠內(nèi)控。在此，基于行業(yè)需求特點(diǎn)，筆者也呼吁將來國家標(biāo)準(zhǔn)可以進(jìn)行改進(jìn)，增加更多簡便等效性方法，以方便更多的檢測行業(yè)可以根據(jù)自身特點(diǎn)靈活應(yīng)用微生物檢測方法。

2.2 現(xiàn)代檢測方法

2.2.1 分子生物學(xué)檢測方法

目前，市場上對突發(fā)感染性或傳染性疫情溯源及預(yù)警的需求越來越多，傳統(tǒng)的分型技術(shù)因分辨能力有限，已無法滿足以上需求，因此促進(jìn)了基因分型技術(shù)的產(chǎn)生——從分子生物水平上研究生物大分子，包括核酸結(jié)構(gòu)及其組成成分?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展起來的基因分型技術(shù)大致分為兩類，即非PCR技術(shù)和PCR的技術(shù)。最初的非PCR基因分型技術(shù)是酶切和雜交方法，需要預(yù)知基因組信息，費(fèi)用巨大，對操作人員的技術(shù)要求也相對較高。PCR技術(shù)的發(fā)明為食源性病原微生物的檢測提供了非常有力的手段，如環(huán)介導(dǎo)等溫核算擴(kuò)增。該方法近年來被食品工業(yè)用戶較多地用于致病菌快速檢測，其操作簡便、增菌時間短、擴(kuò)增時效快且結(jié)果準(zhǔn)確，但不足之處在于工業(yè)用戶對實(shí)驗(yàn)室布局把控尚需改進(jìn)，避免交叉污染帶來的假陽性上作改進(jìn)?；蚍中图夹g(shù)不但為細(xì)菌傳播動力學(xué)提供許多重要的結(jié)論，而且為進(jìn)一步研究細(xì)菌種系發(fā)生特征提供了新的途徑。

2.2.2 ATP生物發(fā)光法

ATP生物發(fā)光法的基本原理是基于死/活菌的ATP含量差別?；畹木w中ATP含量恒定，而菌體死亡后，由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用，菌體中的ATP將迅速被分解，因此可以通過測定待測菌體中ATP的濃度從而計算出活菌數(shù)。與傳統(tǒng)微生物檢測方法相比，ATP生物發(fā)光法檢測食源性微生物時更簡便靈敏、快速高效，并且相關(guān)儀器的開發(fā)應(yīng)用也能同時發(fā)展起來，例如液閃計數(shù)器、照度計等小型化的測試儀器非常便于攜帶，適合在現(xiàn)場對食品衛(wèi)生進(jìn)行檢測，可以說是目前檢測微生物數(shù)目最快捷的方法之一，因此被廣泛應(yīng)用于微生物檢驗(yàn)和食品生產(chǎn)環(huán)境清潔度的檢測。ATP生物發(fā)光法的缺點(diǎn)在于其易受到鹽分及其他化學(xué)物質(zhì)、游離態(tài)等非目標(biāo)的干擾，若忽略這些干擾因素，必然會使檢測結(jié)果受到影響，而且此方法不能區(qū)分微生物與非微生物ATP。近年來，基于ATP技術(shù)原理，許多儀器生產(chǎn)廠家提供了大量解決方案用于商業(yè)無菌檢測，經(jīng)較短于傳統(tǒng)方法報文后，將食品基質(zhì)內(nèi)的ATP進(jìn)行講解，釋放微生物胞內(nèi)ATP，并用儀器進(jìn)行檢測后，從而達(dá)到商業(yè)無菌快速檢測，為廣大乳品、飲料企業(yè)所歡迎的商業(yè)無菌快速檢測方法。

2.2.3 酶聯(lián)免疫技術(shù)

最初的免疫酶測定是使酶與抗體或抗原結(jié)合以檢查組織中相應(yīng)的抗原或抗體的存在。經(jīng)過優(yōu)化發(fā)展，其逐步演變成目前應(yīng)用較廣的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）——首先用固相載體將抗原或抗體吸附，然后在載體上對免疫酶進(jìn)行染色，一段時間后用肉眼或分光光度計進(jìn)行結(jié)果判定分析。酶是一種極為敏感的有機(jī)催化劑，少量的酶便可催化大量的反應(yīng)，其在與抗體或抗原結(jié)合的情況下仍可保持酶本身的生物活性，且不改變抗體或抗原的特性，反應(yīng)后的有色產(chǎn)物可用肉眼定性觀察及用酶標(biāo)儀等光學(xué)儀器進(jìn)行精準(zhǔn)定量檢測。

3. 結(jié)語

綜上所述，由于食品中微生物污染的不可避免性，食品從業(yè)者應(yīng)該重視食品微生物污染，并掌握精準(zhǔn)的檢測方法選擇最適合自身需求的方法，從而快速準(zhǔn)確的找到目標(biāo)微生物，完成檢測的目的，準(zhǔn)確掌握食品微生物污染的情況。因此，進(jìn)一步分析污染源頭，并找出最佳的合理的預(yù)防措施，方能實(shí)現(xiàn)食品中微生物污染監(jiān)控的目的，為食品安全保駕護(hù)航。